检测实验动物用品清洁效果的食品中菌落总数的方法与RODAC方法的应用对比实验

检测实验动物用品清洁效果的食品中菌落总数的方法与RODAC方法的应用对比实验

   ,李彩云，陈啸天 ,谢行舟 ,潘严通讯作者

上海益诺思生物技术股份有限公司 （201203）

摘要： 随着国内许多CRO的蓬勃兴起，依据国家标准和国外的一些指导原则。当前多家CRO对实验动物用物品如笼具等进行清洁和消毒，然后，再对其进行清洁效果的评价。在开放的环境里，动物所用的器具可集中洗刷清洗。在屏障环境里，动物所用物品必须经高压灭菌器高压灭菌后方可投入使用。且将金属笼具清洗干净是为了防止其被动物的排泄物污染氧化生锈，杜绝动物和动物之间交叉感染的隐患，保证实验动物的健康标准。因此，目前常用的实验动物用品的评价方法有两种。一种是食品中菌落总数的测定方法，另一种是RODAC方法。菌落总数方法容易受外界一些因素的影响，环境空气中的落下菌，系统误差等等。RODAC皿已经被广泛地接受用于各种各样的领域，用来评价公共卫生污染水平，特别是众多的机构，诸如食品生产服务机构和医院等等。RODAC方法具备测量效度，可转移性，无需另外配制培养基，简单便捷，节省人力，结果显示比较直观等优势[1]。本文通过两种方法的实验结果做对比来说明两种方法评价结果的一致性。介于RODAC法操作简便，使用市售的TSA凹凸接触皿节省了大量的人力物力，结果可靠的诸多优势，完全可以取代食品中菌落总数的测定方法。

关键词：检测实验动物用品  食品中菌落总数的方法  RODAC方法

1材料与方法：

1.1.1食品中菌落总数的方法所需材料：医用脱脂纱布  由河南亚都实业有限公司提供      智恒牌/ZHWY-100气浴培养摇床上海华耀贸易有限公司   雅马拓/SQ810立式压力蒸汽高压灭菌锅重庆雅马拓公司提供  DP-080电热恒温培养相 由上海帝魄科学仪器有限公司提供 平板计数琼脂 杭州滨河微生物试剂有限公司提供 由NEST公司提供的无菌平皿 

1.1.2：食品中菌落总数的方法，采用25CM2 灭菌纱布块，蘸取灭菌生理盐水展开贴于笼具表面进行采样，采样的时间约为1分钟 采样结束后将纱布置于小锥形瓶内，盖好瓶盖并置于摇床，140run/min震荡15分钟。震荡后将原液稀释成1:1 1:10 1:100 1:1000的样本，取1ml样本+15ml 配制的灭菌后平板计数琼脂倾注于细菌培养皿内，轻轻混匀，待培养基凝固后与空气对照和生理盐水对照一同置于37℃的恒温培养相中培养48小时后观察结果[2]。

1.2.1RODAC方法所需材料：市售55mmTSA 接触皿由青岛海博生物技术有限公司提供。无菌棉签由上海宏隆医疗用品设备有限公司提供。清洗笼具的消毒液是上海派斯德生化有限公司出品，以1:200的比例进行配制。

1.2.2：RODAC方法 市售55mmTSA 接触皿 在采样点周围打开皿盖，避免人员的手接触到培养基表面，将TSA接触皿表面轻轻按压于采样点表面，接触约10秒采样完毕后，将皿盖盖上。与空白对照一同置于37℃的恒温培养相中培养48小时后观察结果[3]。

2结果：

检测结果显示空气环境为合格，对照皿没有长菌落。表明实验成立。依据GB14934-2016食品安全国家标准消毒餐（饮）具标准，猴笼需要检测上下前后左右六个面。整架猴笼六个面消毒前结果不合格（评价标准:菌落数/皿<25为合格）整架猴笼六个面消毒后结果均合格[3]。

结果详见下表

2.1 食品中菌落总数的检测结果：（见表一）

表一：用国标食品中菌落总数的检测方法检测整架猴笼的结果

2.2 RODAC方法检测结果（见表二）

RODAC方法与食品中菌落总数的方法同时在同一个房间用同一个猴笼进行消毒前后进行对比实验。结果显示消毒前整架猴笼六个面均为不合格，消毒后结果表明整架笼具六个面均合格。

表二：用RODAC方法检测整架猴笼的结果

备注：RODAC法评价标准:<=30cfu/皿 为合格

[4]。

2.3食品中菌落总数的方法和RODAC方法两种检测方法的对比表（见表三）

根据两种方法的检测结果列举了表三，从表三的结果可以非常清晰的看出两种方法的结果是一致的。

表三：两种不同检测方法结果的比较表

备注：多不可计代表一块皿上的菌落总数大于500个

结论：

通过上述食品中菌落总数的方法和RODAC 方法实验结果完全可以证实对于实验动物用品的检测RODAC凹凸接触皿方法优于食品中菌落总数的方法。

3讨论：

    3.1现行国标中菌落总数的计数方法，虽然是金标准沿用至今，其准确性、灵敏性均较高但是在实际工作中检测样品需要预处理，需要进行4个梯度的倍数稀释，操作步骤相当繁琐，消耗大量的人力和物力[5]。实验牵涉到前期材料准备、稀释液的制备、平板接种等诸多方面，实验的结果受操作者系统误差因素的影响较大，尤其是菌落数较少的样本，稀释取样具有随机性，结果并不是非常准确等诸多方面，既费时又费力[6]。

3.2 RODAC皿是一种新方法，美国公众开发的直接琼脂压印技术，美国公共卫生协会 （APHA）用于表面采样[7]。RODAC皿已被美国公共卫生协会确定清洁卫生的有效性。实践证明，RODAC皿不仅可以在规则平整的物品表面也可以在不规则或难以接触到的物品表面采集到微生物。RODAC皿使用容易，是小心轻放地将凸起的琼脂表面压在被取样的表面上，必须指出的是，不要将琼脂滑过被压物品的表面，否则会直接影响检测结果[8]。对于消毒后的物体表面的采样，首先要考虑到是否存在消毒剂的残留，防止结果出现假阴性。RODAC接触皿方法与所有的微生物检测方法一样，监测过程中需要48小时的潜伏期，潜伏期之后才能得到结果。长期以来，RODAC皿被证实可以用于确定清洁卫生的有效性的这一目的，其中包括医院，航空航天，兽医外科和食品工业等用RODAC皿来监测卫生程序的有效性。其次，RODAC皿也可以用作清洁技术的监控。例如，定期监测机械洗笼效果是否有效。RODAC皿这种新方法操作简便这一优势显而易见，并且节省了大量的时间，人力和财力。从2种方法的平行试验结果清楚地表明RODAC皿检测方法和食品中菌落总数的检测方法对于动物用品清洗消毒效果评价结果一致。因此，在对动物用品清洗效果评价的时候完全可以使用RODAC皿这种新的检测方法替代食品中菌落总数的方法[9]。

参考文献:

[1]MARYK.Bruch and FREDRICK W.SMITH Improved Method for Pouring RODAC Plate [J］APPLIED MICROBIOLOGY 196816(9)1427-1428

[2]How to better monitor and clean irregalar surfaces in operating rooms Insights gavied by using both ATP Luminescence and RODAC assays [m/ol]http://doi org /10.1016/j.ajic2018.03.024

[3]中华人民共和国国家标准 GB14934-2016食品安全国家标准消毒餐（饮）具[s］2016

[1]MARYK.Bruch and FREDRICK W.SMITH Improved Method for Pouring RODAC Plate [J］APPLIED MICROBIOLOGY 196816(9)1427-1428

[4]中华人民共和国国家标准GB15982-2012  医院消毒卫生标准[S] 2012

[5]吕朝阳 方英 吕朝晖 两种方法检测食品菌落总数的比较 [J］公共卫生与预防医学2006 17（4）55

[6]王晓晔 独立清洁单元消毒模式在重症监护病房医院感染防控中的应用研究[D]安徽 皖南医学院 2017: 1-55

[7]Douglasl.ednie.BARLATG.RoNALDP.WILSON.UMD.MS.andC.MAXLANG.DVM Comparison of two Sanitation Monitoring Medthods in an Animal Research  Facility [J］the American Association  for Laboratory Animal Science 1998  37（6）71-74

[8]张倍宁 卢勉飞 蔡芷荷 吴清平 李斌 李艳嫦 接触皿表面微生物采样效果的评价[J］中国卫生检验杂志 2016 26（17）2473-2476

[9]Comparison of two Sampling metheds for the detection of Gram-positive and Gram-negative bacteria in the environment moistened swabs versus RODAC plates [m/ol] http://www.urbanfischer.de/jourmal/intjhyg