再生障碍性贫血儿童固有免疫和特异性免疫功能分析

【摘要】目的：分析再生障碍性贫血（Aplastic Anemia,AA）患儿的外周血象、固有免疫和特异性免疫功能相关指标。方法：选取2018年1月—2021年10月苏州大学附属儿童医院收治的初诊获得性再生障碍性贫血患儿301例作为实验组（AA），根据患儿病情分为133例重型再障组（Severe Aplastic Anemia,SAA）和168例非重型再障组（Non Severe Aplastic Anemia,NSAA）。同时选取120例健康体检儿童作为对照组。分别检测实验组和对照组的血常规参数（血红蛋白、血小板、白细胞）；固有免疫功能指标：粒细胞总数、中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、NK细胞计数和补体C3、C4水平；特异性免疫功能指标：T淋巴细胞计数、CD3+CD4+计数、CD3+CD8+计数和B淋巴细胞计数，对检测结果进行统计学分析。结果：AA患儿外周血中血红蛋白含量、血小板数量和白细胞计数均明显低于对照组，且SAA组降低更显著（P<0.0001）。固有免疫指标中，SAA组及NSAA组患儿的粒细胞总数、中性粒细胞计数以及嗜酸性粒细胞计数，均低于对照组，且均以SAA组为著（P<0.0001）；SAA组嗜碱性粒细胞（P<0.0001）、NK细胞计数（P=0.0389）均明显低于对照组；SAA组的补体C3、C4水平明显高于对照组（P<0.0001）；NSAA组补体C4水平明显高于对照组（P<0.0001）、补体C3水平与对照组相比无明显差异（P=0.1261）。特异性免疫指标中，SAA组的总T淋巴细胞计数（P=0.0002）、CD3+CD4+计数（P<0.0001）和B淋巴细胞计数（P<0.0001）均低于对照组；SAA组（P=0.3942）和NSAA组（P=0.1492）的CD3+CD8+计数与对照组相比，无明显差异。结论：除补体C3、C4水平升高外，其他反映AA患儿固有免疫功能和特异性免疫功能的指标均出现下降，且与病情严重程度呈正相关。固有免疫功能和特异性免疫功能相关指标的长期监测对AA的临床治疗或预后评估具有重要的意义。

【关键词】儿童；再生障碍性贫血；固有免疫功能；特异性免疫功能

Analysis of Innate Immunity Immune and Specific Immune FunctionsofChildren with Aplastic Anemia

Gao YuanYuan

Laboratory of children's Hospital Affiliated to Suzhou University (Suzhou City, Jiangsu Province) 21500, China

Abstract:Objective: to analyze the peripheral blood picture, innate immunity and specific immune function of children with aplastic anemia (AA). Methods:301 children with newly diagnosed acquired aplastic anemia admitted to the Affiliated Children's Hospital of Suzhou University from January 2018 to October 2021 were selected as the experimental group (AA). According to the condition of the children, they were pided into 133 severe aplastic anemia (SAA) and 168 non severe aplastic anemia (NSAA). At the same time, 120 healthy children were selected as the control group. The blood routine parameters (hemoglobin, platelets and leukocytes) of the experimental group and the control group were detected respectively; Intrinsic immune function indexes: total granulocyte count, neutrophil count, eosinophil count, basophil count, NK cell count and complement C3 and C4 levels; Specific immune function indicators: T lymphocyte count, CD3 + CD4 + count, CD3 + CD8 + count and B lymphocyte count, and the test results were statistically analyzed.

Results: the hemoglobin content, platelet count and leukocyte count in peripheral blood of AA children were significantly lower than those of the control group, and the decrease was more significant in SAA group (P < 0.0001). Among the innate immune indexes, the total number of granulocytes, neutrophil count and eosinophil count of children in SAA group and NSAA group were lower than those in the control group, and the SAA group was the most significant (P < 0.0001); The counts of basophils (P < 0.0001) and NK cells (P = 0.0389) in SAA group were significantly lower than those in control group; The levels of complement C3 and C4 in SAA group were significantly higher than those in control group (P < 0.0001); The level of complement C4 in NSAA group was significantly higher than that in control group (P < 0.0001), and there was no significant difference in the level of complement C3 between NSAA group and control group (P = 0.1261). Among the specific immune indexes, the total T lymphocyte count (P = 0.0002), CD3 + CD4 + count (P < 0.0001) and B lymphocyte count (P < 0.0001) of SAA group were lower than those of the control group; There was no significant difference in CD3 + CD8 + count between SAA group (P = 0.3942) and NSAA group (P = 0.1492) compared with the control group. Conclusion:in addition to the increase of complement C3 and C4, other indexes reflecting the innate immune function and specific immune function of AA children decreased, and were positively correlated with the severity of the disease. The long-term monitoring of innate immune function and specific immune function related indicators is of great significance for the clinical treatment or prognosis evaluation of AA.
Key words：Children; Aplastic anemia; Immunity immune function; Specific immune function

再生障碍性贫血（Aplastic Anemia,AA,简称再障）是一种骨髓造血功能衰竭性综合征，细胞学表现为骨髓造血细胞减少或缺乏、外周全血细胞减少，但无骨髓异常细胞浸润或纤维化。临床表现主要为贫血、出血和感染，一般无肝、脾、淋巴结肿大^[1]。据文献估计，亚洲地区再障的年发病率约为欧美地区的2-6倍，90%以上为获得性再障，且儿童处于再障的高发年龄段^[2,3]

。再障的发病与物理、化学或生物等多方面因素有关^[4]，但目前为止其病因尚未被完全阐明，有研究指出再障患儿的免疫系统功能紊乱与该病的发生发展存在密切关联^[5,6]。本研究对苏州大学附属儿童医院的301例再障患儿进行研究，主要探讨再障患儿的固有免疫功能和特异性免疫功能，为再障患儿免疫系统方面的临床干预提供相关依据。

1.资料与方法

1.1 临床资料

选取2018年1月—2021年10月苏州大学附属儿童医院收治的初诊获得性再生障碍性贫血患儿301例作为实验组（Aplastic Anemia, AA），根据病情分为133例重型再障组（Severe Aplastic Anemia, SAA）和168例非重型再障组（Non Severe Aplastic Anemia, NSAA）。同时选取120例健康体检儿童作为对照组。所有再障患儿的诊断标准均符合《儿童获得性再生障碍性贫血诊疗建议》。所有患儿均为获得性再障，无严重肝、肾功能障碍性疾病，无病毒及细菌感染性疾病病史，无原发性及继发性免疫系统缺陷疾病病史，近期未接受静脉注射免疫球蛋白（IVIG）、抗人胸腺淋巴细胞球蛋白（ATG）及免疫抑制剂药物等治疗，无造血干细胞移植史。参考再生障碍性贫血诊断与治疗中国专家共识（2017年版），重型再障诊断标准为：1）骨髓细胞增生程度<正常的25%；如<正常的50%，则造血细胞应<30%；2）血象：须具备下列三项中的两项：中性粒细胞<0.5×10⁹/L；网织红细胞<1%或绝对值<4×10⁹/L；血小板<20×10⁹/L。

1.2方法

1.2.1固有免疫功能分析

1.2.1.1粒细胞检测

采集患儿的EDTA-K2抗凝静脉血，采用Sysmex XN-1000全自动血液分析仪对患儿外周血中的总粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞进行计数，检测设备每日室内质控均在控。

1.2.2.2补体水平检测

采集患儿空腹静脉血，经促凝剂作用后，分离血清进行补体水平检测。基于液相免疫沉淀反应原理，抗人C3、C4抗体被加入到一定比例的样本和缓冲液中，抗体和样本中的C3、C4产生凝集反应，导致混合物浊度增加，使用临床生化分析仪在340nm波长处检测浊度。

1.2.2.3 NK细胞检测

采集患儿的EDTA-K2抗凝静脉血，加入配套试剂，使试剂中的CD3-、CD16+、CD56+荧光标记抗体特异性与白细胞表面抗原相结合，之后使用溶血素处理染色样本，裂解红细胞。在获取过程中，细胞穿过激光光束并使激光发生散射，同时染色细胞发出荧光。使用FACS CantoⅡ型流式细胞分析仪（美国BD公司）检测散射的荧光信号，了解细胞的大小、内部复杂程度和相应抗原表达强度等信息，分析出CD56+表达量。

1.2.3 特异性免疫功能分析

1.2.3.1 T淋巴细胞检测

检测原理及步骤同“NK细胞检测”，荧光标记抗体为CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+。

1.2.3.2 B淋巴细胞检测

检测原理及步骤同“NK细胞检测”，荧光标记抗体为CD19+。

1.3统计分析

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，剂量资料用（±S）表示，多组间比较采用方差分析，两独立样本均数的比较采用成组t检验，计数资料以百分率（％）表示，组间比较采用c²检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1再障患儿及对照组患儿临床资料分析

男性患儿在SAA组中占58.6%（78/133）、NSAA组中占57.1%（96/168）、对照组中占47.5%（57/120）。SAA患儿外周血中血红蛋白含量73.08±17.19g/L、血小板数量24.21±20.28×10⁹/L、白细胞计数3.18±2.08×10¹²/L，均明显低于对照组（P<0.0001）；NSAA患儿外周血中血红蛋白含量97.44±25.07g/L、血小板数量101.02±122.40×10⁹/L、白细胞计数5.19±2.68×10¹²/L，均明显低于对照组（P<0.0001），以SAA组降低更显著。见表1。

表1三组患儿一般情况及外周血细胞分析相关参数比较

2.2再障及对照组患儿固有免疫功能水平分析

2.2.1粒细胞水平

SAA组及NSAA组患儿的粒细胞总数、中性粒细胞计数以及嗜酸性粒细胞计数均低于对照组，且均以SAA组为著（P<0.0001）；SAA组嗜碱性粒细胞较对照组明显降低（P<0.0001），而NSAA组嗜碱性粒细胞与对照组相比无明显差异（P=0.0978）。如图一。

图一 三组患儿之间粒细胞总数、中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数结果分析

2.2.2 NK细胞

SAA组NK 细胞计数明显低于对照组（P=0.0389），而NSAA组与对照组相比（P=0.0971）、SAA组与NSAA组相比（P=0.9778），均无明显统计学差异。如图二。

图二 三组患儿之间NK细胞计数结果分析

2.2.3补体水平

SAA组的补体C3、C4水平明显高于对照组（P<0.0001）；NSAA组补体C4水平明显高于对照组（P<0.0001）、补体C3水平与对照组相比无明显差异（P=0.1261）。如图三。

图三 三组患儿之间补体水平分析

2.3再障患儿及对照组患儿特异性免疫功能分析

2.3.1 T淋巴细胞水平比较

SAA组的总T淋巴细胞计数（P=0.0002）、CD3+CD4+计数（P<0.0001）均低于对照组；SAA组（P=0.3942）和NSAA组（P=0.1492）的CD3+CD8+计数与对照组相比，无明显差异。如图四。

图四 三组患儿之间T淋巴细胞水平分析

2.3.2 B淋巴细胞水平比较

SAA组及NSAA组B淋巴细胞计数明显低于对照组（P<0.0001）；SAA组与NSAA组之间相比，B淋巴细胞计数无明显差异（P=0.0794）。如图五。

图五 三组患儿之间B淋巴细胞水平分析

3讨论

本研究通过对SAA和NSAA患儿的外周血象观察，发现AA患儿外周血中血红蛋白含量、血小板数量和中性粒细胞计数均有减低，且以SAA组减低更为显著，表明AA患儿存在全血细胞减少，且SAA患儿严重于NSAA患儿，这符合AA的外周血象特点。由于骨髓造血功能的衰竭，患儿粒细胞减少，往往会出现难以纠正的感染，如发热、咳嗽等；患儿贫血类型主要为正常红细胞、正常色素型^[7]，往往表现为头晕、乏力等。

固有免疫是指种系在发育和进化过程中形成的一种生来就有的天然免疫，本研究检测了一些反映患儿固有免疫功能的指标，包括：粒细胞总数、中性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、嗜碱性粒细胞计数、NK细胞计数以及补体水平。粒细胞又称为白细胞，是体内抵御炎症感染的重要细胞，根据其瑞氏染色下的表现可以分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞三类。中性粒细胞是最常见的吞噬细胞，可快速包裹并吞噬经抗体或补体处理的异物，随后转化为脓细胞而死亡，中性粒细胞作为诊断再障病情严重程度的一项指标，对病情轻重程度及疗效判断具有重要的意义，中性粒细胞严重减少是一种骨髓造血不良的表现^[8]。本研究发现，AA患儿的总粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞计数均呈显著下降趋势，且与病情严重程度成正相关，提示再障患儿的骨髓造血能力存在减退甚至衰竭。NK细胞来源于骨髓，是人体天然的免疫细胞，在机体的免疫监视、免疫调节等过程中发挥着重要的作用，能够识别并吞噬、杀灭人体中的老化细胞，同时也能识别被病原体感染的细胞和异常增殖的肿瘤细胞。NK细胞的数量异常可能与AA及其他恶性血液疾病的发病相关^[9,10]。本研究中，AA患儿的外周血中NK细胞数量明显减少，且病程越重，NK 细胞数量减少越明显，这可能是由于患儿骨髓病变及造血微环境损伤，不能有效支持NK细胞的分化发育及成熟，导致骨髓中NK细胞的生成减少，外周血中NK细胞计数减少。补体主要由肝脏和巨噬细胞产生，生理情况下其合成、活化和灭活过程处于一种动态平衡，故血清含量稳定。补体C3是血清中含量最高的补体成分，在补体经典激活途径和旁路激活途径中均发挥重要作用；补体C4的增高见于各种传染病、急性炎症、组织损伤、多发性骨髓瘤等^[11,12,13]。在炎症和免疫反应中，抗原抗体和一些炎症细胞因子对补体固有成分的合成具有上调作用。本研究中AA患儿的补体C3、C4水平明显上升，可能因为再障患儿骨髓造血功能衰竭，肝脏残留的造血功能被代偿性激活，导致补体在肝脏中的合成增加，血清中补体成分增高，也可能由于再障患儿的补体激活途径受阻，导致C3、C4无法继续转化，血清中含量上升。本研究通过分析AA患儿的粒细胞水平、NK细胞计数以及补体C3、C4水平，得出AA患儿的固有免疫功能整体存在明显的下降趋势，且与病情严重程度成正相关。

与成人相比，儿童接触外界环境中病原体的时间较短、数量及种类较少，体内的特异性免疫功能相对较弱，而特异性免疫功能和细胞因子的改变在AA的发病中起着核心作用^[14]。CD3+CD4+T细胞主要促进B细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTL

）和其他免疫细胞的增殖和分化，调节体液免疫和细胞免疫功能，CD3+CD4+T细胞内存在两类细胞亚群，Th1细胞和Th2细胞，Th1细胞分泌IL-2、IL-12以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、干扰素-γ（IFN-γ）等细胞因子，介导免疫反应和迟发型超敏反应，并可辅助B细胞产生与吞噬作用有关的抗体；Th2型细胞因子，包括IL-4、IL-6、IL-10等，主要参与B细胞的增殖和分泌抗体，增强抗体介导的体液免疫应答，维持机体体液免疫及细胞免疫的正常功能^[15,16]。CD3+CD8+T细胞属于负性造血调控因素，激活的CD3+CD8+T细胞可通过释放细胞毒素，包括穿孔素、颗粒酶和颗粒溶解素，直接抑制造血，可导致严重的免疫缺陷。AA中CD3+CD8+T细胞能够同时通过细胞表面膜分子及其分泌的可溶性细胞因子间接抑制造血^[17]。临床上利用免疫抑制剂治疗AA患儿有效，尤其对SAA患儿效果显著，其作用环节可能与抑制CD3+CD8+T细胞有关。本研究通过检测AA患儿的T淋巴细胞亚群发现，AA患儿体内总T淋巴细胞（CD3+细胞）、CD3+CD4+细胞表达量明显减少，而CD3+CD8+细胞表达量无明显变化，提示再生障碍性贫血患者的T淋巴细胞亚群分布发生了改变，细胞免疫系统遭到了破坏。B淋巴细胞可以在抗原的刺激下分化为浆细胞，浆细胞可以合成并分泌抗体，主要执行机体的体液免疫功能。本研究得出，AA患儿的B淋巴细胞计数明显下降，提示患儿存在一定的体液免疫功能下降。总结AA患儿的T淋巴细胞计数、CD3+CD4+计数、CD3+CD8+计数和B淋巴细胞计数，分析得出AA患儿的特异性免疫功能明显下降。

综上所述，AA患儿的固有免疫功能和特异性免疫功能均出现下降，其下降程度与病情严重程度呈正相关。因此，固有免疫功能和特异性免疫功能的长期监测对AA的临床治疗或预后评估具有重要的意义。

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