鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留测定回收率较低的因素探索

鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留测定回收率较低的因素探索

刘云龙1，倪饶颖1，黄琴1，曹红梅2，刘文涛2

息烽县农产品质量安全检验检测中心  贵州息烽  551100

摘要：探索《农业部781号公告-6-2006  鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定  高效液相色谱法》中方法回收率较低的原因。方法：样品经磷酸二氢钾溶液提取后，用水饱和正己烷去酯，用C18SPE柱净化。对不同品牌不同类型的C18小柱、不同提取体积、不同洗脱液体积、洗脱液中乙腈的不同比例等因素对阳性添加样品中氟喹诺酮的回收率进行研究，探索最佳方案。结论：提取体积20mL，分取体积5mL，用安捷伦C18100mg/3mLSPE柱净化试样时，用1mL洗脱液（0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液体积：乙腈=81：19）洗脱，回收率均在70%以上；用1.5mL洗脱液洗脱，回收率达80%以上。若用安捷伦C18200mg/3mLSPE柱净化试样，1.5mL洗脱液洗脱效果较好；洗脱液中0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液体积：乙腈溶液体积=70：30时效果最佳。

关键词：鸡蛋；氟喹诺酮；高效液相色谱法；回收率

Exploration on the factors of low recovery rate in the determination of Fluoroquinolones Residues in eggs

Liu Yunlong 1, Ni raoying 1, Huang Qin 1, Cao Hongmei 2, Liu Wentao 2

(Xifeng County agricultural products quality and safety inspection and testing center Guizhou Xifeng 551100)

Abstract: To explore the reasons for the low recovery rate of the method in the announcement of the Ministry of agriculture No. 781-6-2006 determination of Fluoroquinolones Residues in eggs by high performance liquid chromatography. Methods: the samples were extracted with potassium dihydrogen phosphate solution, desorbed with saturated n-hexane and purified with c18spe column. The recovery rate of fluoroquinolone in positive samples was studied by different brands and types of C18 small columns, different extraction volumes, different eluent volumes, and different proportions of acetonitrile in eluent, so as to explore the best scheme. Conclusion: the extraction volume is 20ml, and the separation volume is 5ml. When the sample is purified with Agilent C18100mg/3mlspe column, it is eluted with 1ml eluent (0.05mol/l phosphoric acid triethylamine solution volume: acetonitrile =81:19), and the recovery is more than 70%; Elute with 1.5ml eluent, and the recovery rate is more than 80%. If Agilent C18200mg/3mlspe column is used to purify the sample, the elution effect of 1.5ml eluent is better; 0.05mol/l phosphoric acid triethylamine solution volume in eluent: the best effect is when acetonitrile solution volume =70:30.

Key words: egg; Fluoroquinolone; High performance liquid chromatography; rate of recovery

1.引言

氟喹诺酮类药物属于喹诺酮类药物，是人工合成的抗菌药物，因化学结构中含氟，所以又被称为氟喹诺酮类药物。氟喹诺酮类药物通过抑制细菌DNA的合成来杀灭细菌，属于杀菌剂，用于治疗各种细菌感染，比如用于呼吸道感染、胃肠道感染、泌尿生殖系统感染，以及皮肤和软组织感染，有比较好的抗菌活性。长期食用被药残污染的食品可使人类病原菌产生耐药性，可引起变态反应，具有潜在的致癌、致畸、致突变的威胁［1］，目前常用的检测方法有液相色谱-质谱联用法、液相色谱法及酶联免疫法等，本研究主要针对大部分县级农产品检测机构因经费困难不具备质谱仪，只有液相色谱仪而采用的《农业部781号公告-6-2006  鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》中的方法回收率较低的普遍现象，探索不同因素对鸡蛋中氟喹诺酮类药物加标回收率的影响，为广大基层农检机构提高鸡蛋中氟喹诺酮类药物的检测能力提供参考。

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2.材料与方法

2.1材料

环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、恩诺沙星标准品（浓度为100ug/1.2ml，坛墨质检）；乙腈、甲醇、正己烷（色谱纯，霍尼威尔）；三乙胺（色谱纯，天津化学试剂）；磷酸（优级纯85%，成都科隆）；氢氧化钠、磷酸二氢钾（分析纯，天津永晟）。C18固相萃取柱（以下简称SPE柱）共3个品牌，分别为安捷伦，迪马，喆分，0.45um尼龙滤膜，0.22um有机滤膜。

2.2仪器

Agilent  1220液相色谱仪配荧光检测器（美国安捷伦），Scout SE 百分之一电子天平（奥豪斯），XW-80A涡旋振荡混合器（上海精科实业），TGL 16M离心机（长沙迈佳森）

2.3色谱条件

C18色谱柱(250mm×4.6mm×0.5um)，流动相：0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液体积：乙腈溶液体积=81:19，流速1.0ml/min，荧光检测器激发波长280nm，发射波长450nm，进样量20ul，柱温30℃。

3.实验内容

3.1溶液配制

3.1.1  标准储备液配制。精确吸取浓度均为100ug/mL的环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星各1.00mL、达氟沙星0.25mL于25.0mL容量瓶中，用甲醇定容，作为储备液（环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星均为4.00ug/mL、达氟沙星1.00ug/mL），置于2-4℃冰箱中保存，有效期3个月。

3.1.2   标准工作液配制。精确吸取不同体积的储备液，用流动相稀释，配制成环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星分别为0.40、0.12、0.048、0.0096、0.0048ug/mL，达氟沙星为0.10、0.03、0.012、0.0024、0.0012ug/mL的标准工作液。

3.1.3  相关溶液的配制。

1）氢氧化钠溶液5.0mol/L：取28mL饱和氢氧化钠溶液用水定容至100mL；

2）0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液：取85%磷酸6.8mL用水定容至2000mL，用三乙胺调pH至2.4；

3）磷酸盐提取液：取磷酸二氢钾6.8g，加水溶解并稀释至500ml，用5.0mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.0；

4）流动相：量取0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）810mL和乙腈溶液190mL，混合振荡，过0.45um尼龙滤膜，超声，现用现配。

5）乙腈（30％）-磷酸缓冲液：量取0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）70mL和乙腈溶液30mL，混合振荡，过膜，超声；

6）洗脱液：按照变量设计的比例精确量取0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）和乙腈溶液，混合振荡，过膜，超声；

3.2   样品制备  

取新鲜鸡蛋30枚，去壳后高速匀浆（经检测不含试验中所涉及的4种沙星），装入样品盒置于-20℃冰柜中保存。

3.3 供试材料准备

1）空白对照：取匀浆后的样品作为供试材料，不添加储备液，直接提取净化；

2）阳性添加试样：取匀浆后的样品200g，添加储备液5mL，配制成环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星100ug/kg，达氟沙星25ug/kg的阳性添加试样。

3.4实验步骤

3.4.1试样提取：称取2g阳性添加样品置于50mL离心管中，加入磷酸提取液，旋涡振荡5min，5000r/min下离心10min，上清液转入另一离心管中。再取同体积磷酸提取液洗残渣，搅匀，振荡，离心。合并2次上层清液于同一离心管中，加入10ml水饱和的正己烷，振荡5min，5000r/min下离心10min，用吸管将下层溶液转移至另一离心管中再次加入10ml水饱和的正己烷，振荡，离心。弃去上层正己烷，下层为备用液。

3.4.2净化：取C18SPE柱，依次用5ml乙腈、5ml乙腈（30％）-磷酸缓冲液和5ml磷酸盐提取液润洗，取备用液5mL过柱，用3ml水洗，真空抽干。用洗脱液洗脱，挤干，过0.45um滤膜，收集洗脱液作为试样溶液，供高效液相色谱仪分析。

4.变量设计

4.1不同品牌、规格的C

18SPE柱

选取安捷伦牌规格为100mg/1mL、100mg/3mL、200mg/3mL、500mg/6mL；迪马牌规格为100mg/1mL、100mg/3mL、200mg/3mL和喆分牌规格为100mg/3mL共3个品牌8种规格的C18SPE柱净化试样，比较回收率结果。

4.2  不同的提取体积、分取体积、洗脱体积

改变提取体积（4mL、10mL、20mL）、分取体积（提取体积4mL全过SPE柱，提取体积10mL和20mL的只取5mL过柱）、洗脱体积（1mL、1.5mL，流动相），探索回收率的变化。

4.3不同比例的洗脱液

改变洗脱液中0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）VA与乙腈体积VB的比例（VA：VB=70:30、73:27、76:24、79:21、82:18），比较回收率结果。

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图1 环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星标准品色谱图

图2   环丙沙星标准曲线            图3   达氟沙星标准曲线

图4   恩诺沙星标准曲线             图5   沙拉沙星标准曲线

5.结果与分析

5.1  标准曲线的绘制。4种氟喹诺酮标准品工作液液相色谱图如图1所示，4种标准品标准曲线及回归方程如图2、图3、图4、图5所示。

5.2   不同品牌、规格的C18SPE柱

选取安捷伦牌规格为100mg/1mL、100mg/3mL、200mg/3mL、500mg/6mL；迪马牌规格为100mg/1mL、100mg/3mL、200mg/3mL和喆分牌规格为100mg/3mL共3个品牌8种规格的C18SPE柱 。

表1       不同品牌、规格的C18SPE柱回收率结果表

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从表1结果可看出：

1）迪马牌和喆分牌的C18SPE柱回收率除大多在40%左右，基本不能适用于方法《农业部781号公告-6-2006  鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》；

2）安捷伦牌C18SPE柱除规格500mg/6mL的回收率太低外，其余3种规格的回收率基本满足方法70-100%的要求，其中以100mg/1mL回收率最优，分别为环丙沙星91.51%、达氟沙星87.5%、恩诺沙星96.49%、沙拉沙星90.35%，其次是100mg/3mL，回收率分别为环丙沙星86.05%、达氟沙星78.28%、恩诺沙星85.77%、沙拉沙星68.75%，，最后为200mg/3mL，回收率分别为环丙沙星80.3%、达氟沙星70.22%、恩诺沙星68.26%、沙拉沙星62.89%。

3）虽然100mg/1mLSPE柱回收率最优，但容积规格太小，在净化过程中较为耗时费力，故选择100mg/3mL和200mg/3mLSPE柱继续进行下一步试验。

5.3 不同的提取体积、分取体积、洗脱体积

分别用100mg/3mL和200mg/3mL两种规格的安捷伦C18SPE柱净化试样，改变提取体积（4mL、10mL、20mL）、分取体积（提取体积4mL全过SPE柱，提取体积10mL和20mL的只取5mL过柱）、洗脱体积（1mL、1.5mL，流动相），结果如表2、表3所示。

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表2        安捷伦100mg/3mL，不同提取、分取和洗脱体积结果表

表3     安捷伦200mg/3mL，不同提取、分取和洗脱体积结果表

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从表2、表3中可得出结论：

1）随着提取体积的增加，回收率逐渐升高。原因分析：一是增加提取体积，提取效果会更加彻底；二是在用正己烷除酯过程中，若不分取，会有部分提取液因除酯操作而损失，造成回收率偏低，若分取，提取液损失较小，回收率较为稳定，但随着提取体积增大方法检出限会降低；

2）随着洗脱液体积的增加，回收率逐渐提高。原因分析：洗脱液体积增加，洗脱效果将更彻底，回收率随之提高。

3）随着SPE柱填料增加，相同体积的洗脱液洗脱效果降低。原因分析：随着SPE柱填料增加，填料对目标物的吸附加强，洗脱目标物所需洗脱液也相对增加。

5.4不同比例的洗脱液

用200mg/3mL规格的安捷伦C18SPE柱净化试样，改变洗脱液中0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）VA与乙腈体积VB的比例（VA：VB=70:30、73:27、76:24、79:21、82:18），用1mL洗脱液洗脱。结果如表4所示。

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表4      洗脱液中有机相不同配比对回收率的影响

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从表5中得出，洗脱液中乙腈体积比为30%时，4种沙星的回收率均在80%以上，其余比例部分达80%以上，随着有机相比例的降低，回收率出现下降趋势。

度与提取液中浓度相同，回收率稳定，但随着提取体积增大方法检出限会降低；

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6  结论

3）用安捷伦100mg/3mL规格的C18SPE

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1）在做鸡蛋中氟喹诺酮类药物检测时，所采用的C18SPE柱必须先经过添加回收率试验。许多县级农检机构反应称用《农业部781号公告-6-2006  鸡蛋中氟喹诺酮类药物残留量的测定高效液相色谱法》测定鸡蛋中氟喹诺酮类药物的回收率只有30~40%，SPE柱选取是其中的重要因素。安捷伦牌中100mg/3mL和200mg/3mL两种规格的C18SPE柱均能满足方法对回收率的要求。

2）在对鸡蛋中氟喹诺酮类药物进行提取时，采用20mL磷酸盐提取液提取相对效果最佳。方法781-6-2006中提取液只有4mL，用正己烷除酯后，总是有部分提取液在除酯过程中损失，剩余提取液体积有时不足2mL，但计算仍按4mL计，造成回收率偏低；同时，增加提取体积，提取效果会更加彻底；分取液中目标物浓

柱，提取液20mL，分取5mL时，分别用1mL和1.5mL洗脱液洗脱，回收率均能满足70~100%的要求；若换成200mg/3mL SPE小柱后，必须加大洗脱液体积，采用1.5mL洗脱液才能满足回收率要求。

4）洗脱液中有机相的比例以0.05mol/L磷酸-三乙胺溶液（PH=2.4）：乙腈溶液=70：30效果较好，在用安捷伦200mg/3mLC18SPE柱净化试样，1mL洗脱的条件下，回收率均在80%以上，且分离度和峰形均较好。若提高洗脱液中乙腈的比例，样液中有机相比例增加后，对分离度和峰形是否会造成影响还需进一步探索。

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参考文献

［1］闫  冰，杨艳坤，何世岷    滥用氟喹诺酮类药物的几点建议，兽药饲料，2019年7月（下）

［2］孙思、王安波，杨梅等     超高效液相色谱法检测鸡蛋中4种氟喹诺酮类药物残留   贵州农业科学  2018.46（1）：104~108

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