病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果

病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果

朱秋韵

张家界市人民医院检验科   湖南张家界  427000

【摘要】目的 分析病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果。方法 选取2021年05月-2022年05月本院110例病原微生物检验患者，用随机数字表法平均分为对照组55例，行免疫荧光检验法，观察组55例，行实时荧光定量RT-PCR 法，比较两组检验效果。结果 观察组病原微生物检验为阳性例数为53例，检出率96.36%，对照组微生物检验为阳性例数为45例，检出率为81.82%，观察组的阳性检出率明显高于对照组（P＜0.05）；观察组的检验满意率98.18%明显高于对照组的85.45%（P＜0.05）。 结论在病原微生物检验中应用实时荧光定量RT-PCR法能够显著提升检验效果，患者满意率高，具有推广价值。

【关键词】病原微生物检验；分子生物学技术；实时荧光定量RT-PCR

近些年来，医学和科技持续发展，人类健康和微生物之间的关系越来越深刻。以保障饮用安全、医疗用品安全、食品安全和化妆品安全等为目的，微生物检验发挥着重要作用，同时在监测环境，疾病临床诊治等领域，该技术也得到广泛应用。病原微生物会侵入机体，形成感染，部分患者会出现传染病，又名为病原体。病原微生物检验采取样本主要为人体尿液、排泄物和血液等，展开培养、分离和化验等措施，实施传统手段，效果明显，但是存在耗材、耗力和耗时等问题，难以实现快速检测[1]。分子生物学技术是一种新兴技术，将其应用于微生物检验中，能够提升检验速率，为临床工作提供全面、精准信息依据。本次研究以接受病原微生物检验患者为对象，分析分子生物学技术的应用效果。

1  资料和方法

1.1一般资料

选取2021年05月-2022年05月本院110份病原微生物检验样本，用随机数字表法平均分为对照组55例，男28例，女27例，年龄为21-58岁，平均年龄（38.18±4.89）岁；观察组55例，男29例，女26例，年龄为22-59岁，平均年龄（38.76±4.13）岁。两组一般资料（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法

对照组行免疫荧光检验法：选取荧光检测试剂盒，来源于美国DHI公司，取得喉部、咽部、鼻部分泌物2-3毫升，用无菌生理盐水储存。反复吹打分泌物，放入离心管中，展开离心处理。采取磷酸盐缓冲液洗涤沉淀物，混合在一起，再次实施离心处理，反复进行上述操作，一直到上清液清澈，取得细胞悬液。点滴在载玻片上，固定，进行荧光染色，根据说明书展开检验。

观察组行实时荧光定量RT-PCR法：选取肝素展开抗凝处理，将核细胞分离，准备制作RNA，应用TRIzol一步法，将总RNA提取出来，展开纯化处理，对abl基因进行克隆，然后放置于PUCm-载体上。转化重组质粒，对含菌株展开筛选处理，扩增处理，提取处理，进行鉴定，应用纯化技术，最后对鉴定结果进行检测。实施定量，借助阿佛加德罗常数及分子量，得到分子拷贝数，展开109拷贝/μl10倍稀释，获取到阳性模板，将其放置于零下20℃冰箱中，备用，于QR-PCR仪上，选取TaqMan探针，检查基因情况，实施基因表达。设置条件，建立能力循环，基于预变性条件，将温度设置为95℃，持续15分钟；基于变性条件，将温度设置为94℃，进行30秒；基于退火条件，将温度设置为52℃，持续1分钟；基于延伸条件，将温度设置为72℃，进行1分钟，共进行15个循环。针对第二个循环，将温度设置为94℃，进行15秒；将温度设置为70℃，持续1分钟，共进行6个循环。针对第三个循环，将温度设置为94℃，进行15秒，然后转换为52℃，进行15秒，最后调整为72℃，进行15秒，共计循环30个。针对最后延伸，将温度设置为72℃，共进行3分钟。针对贮存，将温度设置为4℃，共进行50分钟。选取圣湘宏石扩增仪，荧光等离激元光学生物传感器，检验病原菌，根据说明书展开操作。阳性判断标准为：荧光强度中位值（MFI）高于阴性平均结果的平均值和5之和乘标准差，或者高于250。

1.3观察指标

1.3.1评价病原微生物阳性检验结果：观察两组病原微生物阳性检出例数，阳性检出率=阳性检出例数/总例数×100。

1.3.2评价病原微生物检验满意率：采取满意率调查问卷，本院自拟，分值0-100分，满意（超过80分）、基本满意（60-80分）和不满意（小于60分），（满意例数+基本满意例数）/总例数×100%=检验满意率[2]。

1.4统计学分析

SPSS23.0处理数据，（%）表示计数资料，行检验，P＜0.05，差异有统计学意义。

2  结果

2.1两组病原微生物阳性检验结果比较

观察组病原微生物检验为阳性例数为53例，检出率96.36%，对照组微生物检验为阳性例数为45例，检出率为81.82%，观察组的阳性检出率明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1 两组病原微生物阳性检验结果比较[

n(%)]

2.2两组病原微生物检验满意率比较

观察组的检验满意率98.18%明显高于对照组的85.45%，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

表2 两组病原微生物检验满意率比较[n(%)]

3 讨论

21世纪起，分子生物学技术持续发展，生命科学时代到来，借助分子生物学技术，展开基因诊断，不管是在医学，还是在遗传学领域，均具有显著优势。近些年来，现代医学发展迈入新纪元，逐渐过渡到基因水平、细胞水平向分子水平，衍生出分子微生物学。随着该技术诞生，人们对微生物认知越发深入，从以往的外部结构体征，逐渐转换为内部基因结构，就微生物检验而言，其也从生化免疫法，转换为基因水平[3]。当下，分子生物学高速发展，常见类型有聚合酶链反应、基因芯片、生物传感器等技术等，具有高度自动化、敏感性高和特异性高等特征，能够快速检测出疾病，临床操作快速、高效，可以有效鉴别病原微生物，诊断效果准确、科学。

在生命科学领域中，聚合酶链式反应（PCR）是一种应用最广泛的分子生物学技术，在体外酶作用下，形成DNA片段，具有重复和循环等特征，能够促使DNA指数快速生长，起到扩增功效。经相关研究表明[4]，分析PCR反应原因，发现其和DNA天然复制存在相似性，就其一轮循环而言，其主要包括以下几个过程：其一为变性，将温度设置为93-95℃，解离双链DNA，令其转换为单链。其二为退火，将温度控制在适宜范围内，在单链DNA模板上，令引物在特意区域进行结合和配对。其三为延伸，将温度设置为72℃，引物为Taq DNA 聚合酶，底物为dNTP，遵循碱基互补配对原则，促使模板DNA链合成，将其看作是互补新链。进行循环，共计30个，目的基因会呈现出扩增趋势，迅速达到一百万，甚至更多。在进行PCR检验时，引物设计发挥着重要作用。和传统微生物检验相比，PCR检验具有更高的灵敏度，特别是对于病毒而言，其灵敏度能够达到3个RFU，在检验细菌时，该方式至少能够检出3个细菌。该方式具有较强特异性，能够准确鉴别多种微生物型，临床操作简单，一般情况下，检验时间约为1-2个小时[5]。当下，临床常见PCR技术有定时定量PCR、多重PCR和逆转录PCR等。

采取荧光定量PCR技术，将荧光基团加入PCR反应体系中，通过积累荧光信号，对PCR进程展开监测，然后借助标准曲线，定量分析未知模板。经相关研究显示[7]，每个模板起始拷贝对数均和其Ct值存在明显线性关系，检验人员能够从标准曲线上，获取到起始拷贝数。采取该检验方式，能够快速检验核酸，应用荧光探针，对特定核酸进行标记，具有更高准确性，可以在1小时内取得结果，应用样本量更少，能够有效简化试验步骤，和传统PCR检验相比，该方式用时更多，准确性更高，但是检验结果有可能受核污染影响[8]。冯燕于2005年根据荧光探针特异性，提出实时PCR检验，并在SARS病毒核酸检验中得到应用。采取TaqMan荧光定量PCR技术检验病毒，特异性高，敏感性高，不会和其他呼吸道病毒产生交叉反应，其检验灵敏度能够达到0.1TCID50，花费时间更短，从提取核酸开始，到完成检测，用时不超过3小时，具有更好重现性[9]。Yang等医学家在2007年以SYBR荧光染料为基础，应用实时PCR技术，在人类分辨中检验到鼠伤寒沙门菌invA基因和福氏志贺菌virA基因，前者最低限为2×10CFU/g，后者最低限为1×10CFU/g。该方式具有较高特异性和灵敏性，临床操作快速、简便，无须对DNA展开纯化处理。Lehmann于2008年开展多重实时定量PCR检验，能够将25种血源性感染病原微生物检验出来，利用该技术，仅需获取患者外周血3毫升，从准备标本开始，到分析数据，花费时间低于6小时。临床检验快速，可行性高。应用等温扩增技术，对实验室和仪器条件提出的要求低，能够有效降低检验时间，在核酸检验中发挥着重要作用。当下，临床上已知的核酸等温扩增技术有环介导等温扩增技术、解旋酶扩增技术、转录依赖的扩增技术、链置换扩增技术、Q复制酶反应、切口酶恒温扩增技术、解旋酶扩增技术以及环介导等温扩增技术等[10]。应用链置换扩增技术，该技术起源于1992年，由Walker提出，其属于体外恒温扩增核酸技术，该方式会增加实验步骤，选择目标DNA序列时，受到限制。同年，Walker对其进行改进，得到了SDA方法，可以提升检验效率。本次研究结果表明观察组病原微生物检验为阳性例数为53例，检出率96.36%，对照组微生物检验为阳性例数为45例，检出率为81.82%，观察组的阳性检出率明显高于对照组（P

＜0.05），表示在病原微生物检验中，实时荧光RT-PCR能够取得显著检验效果，表示分子生物学技术作用明显。李玲、孙文龙等学者提出，在生物学领域，PCR应用广泛，在体外酶作用下，形成DNA片段，包括延伸、变形和退火等步骤，可以实现指数级，发挥出扩增DNA功效，同时该检验方法速度快，具有较高准确性，能够有效提升病原微生物检验效果。观察组的检验满意率98.18%明显高于对照组的85.45%（P＜0.05）。王俊芳以220例患者为研究对象，一组实施常规反转录RT-PCR法，一组实施实时荧光RT-PCR法，结果表明，后一组的检验满意率为94.55%，前一组的为82.73%，后者更高，和本次研究结果一致。表示实时荧光RT-PCR检验效果显著。

综上所述，在病原微生物检验中应用实时荧光定量RT-PCR法能够显著提升检验效果，患者满意率高，具有推广价值。

参考文献：

[1]谭颖,刘艳军,王艳华,林琳. 快速血清学检验和微生物快速培养检测对肺炎支原体感染患儿的诊断价值[J]. 中国医药指南,2020,18(25):93-94.

[2]罗汝斌,黄曼,胡行,张嵘,韩春茂. 严重爆炸致烧伤患者感染病原微生物的特征及宏基因组学第二代测序技术在病原微生物检测中的应用[J]. 中华烧伤杂志,2021,37(10):946-952.

[3]沙巍. 规范合理使用分子生物学检测技术以早期精准诊断结核病[J]. 中国防痨杂志,2021,43(10):983-986.

[4]陶立玉,高秀莲,徐桂荣. 快速血清学检验、微生物快速培养检测用于诊断小儿肺炎支原体感染的临床价值分析[J]. 中国实用医药,2021,16(26):31-33.

[5]李姗姗,孙雁斐,郭艺,杨芳. 基于单细胞拉曼技术的口腔病原微生物快速鉴别研究[J]. 口腔医学研究,2021,37(9):794-799.

[6]郝昕蕾,张依,李雪杰,金玮,杨安怀. 二代测序技术在外源性眼内炎患者病原微生物检测中的应用[J]. 眼科新进展,2021,41(8):750-754.

[7]张世佳,冯建军,郭松林,王艺磊,林鹏. 滚环扩增技术在病原微生物检测中的应用[J]. 分析测试学报,2021,40(10):1538-1544.

[8]贾亦斐,陈晨,王立平,孙晴,胡永奇. 腹泻患儿粪便中病原微生物的检验及意义分析[J]. 山西医药杂志,2021,50(4):649-650.

[9]徐泽炎,吴莺. 分子生物学技术在诺如病毒检测中的应用[J]. 临床检验杂志,2020,38(1):44-47.

[10]王海晶,王小军. 实时定量PCR与传统微生物培养法诊断呼吸机相关性肺炎病原体的性能比较[J]. 临床肺科杂志,2020,25(6):811-815.