几种常见的结核分枝杆菌快速检测方法

肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。

近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。

传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。

细胞沉淀仪法：利用细胞沉淀仪将无菌体液中的结核杆菌收集到无菌玻片上，完成制片，固定标本，然后再做传统染色检测，和以上步骤相同。

改良的抗酸染色法联合细胞沉淀仪法：利用细胞沉淀仪将无菌体液中的结核杆菌收集到无菌玻片上，完成制片，使用改良染色法固定标本，在染液中加入3g/L的Triton X －100，使脂质溶解，将燃料、结核杆菌的结合率大大提升，然后在待检玻片上涂抹Triton X －100，浸泡半个小时，然后使用磷酸盐缓冲液进行冲洗，每次洗涤3-5分钟，共需洗涤3次，玻片自然干燥之后，将其置于染色加，然后滴加石炭酸复红溶液，盖满拨片，持续染色15min，然后使用蒸馏水冲洗染色液，滴加盐酸酒精溶液，盖满拨片，然后脱色处理2-3min，处理两次，然后使用蒸馏水冲洗盐酸酒精溶液，沥干水分，使用亚甲基蓝溶液染色，之后使用蒸馏水冲洗，等到涂片干燥后，作镜检。

萋-尼氏抗酸染色法：通过萋-尼氏抗酸染色法时，需要加热5分钟，在1000×镜下对标本进行观察。

金胺O荧光染色法：金胺O荧光染色法需要冷染15-20min之间，在400×镜下进行观察。

PCR技术：以PCR技术为代表的基因检测方法对结核病用非直接培养技术快速检测的又一个突破。①实时荧光定量PCR技术的特点就包括：特异性强、灵敏度高、定量准确、检验时间较短，更易标准化可以广泛应用在致病菌的鉴定中以及临床药物实验中。实时荧光定量PPCR技术能够额定结核分枝杆菌的含量，该方法应用，可通过探针结合PCR产物，精确计算扩增产物，实现可重复性的定量检测。另外，实时荧光定量PCR技术还能够检查结核病患者治疗前后的痰液标本，发现在治疗后患者的痰液标本中的DNA拷贝数量显著降低，由此可见，实时荧光定量PCR技术能够有效治疗患者，并有效监控结核病患者的治疗效果。②核酸恒温扩增技术属于PCR技术后发展的一种新型体外核酸扩增方法，该技术的特点包括：恒温性、高效性、特异性、无需特殊检验仪器。该方法能够快速得到准确性高的检测结果，并且可以降低检测成本。尤其是其中的环介导等温扩增技术以及实时荧光核酸恒温扩增技术广泛应用在结核杆菌的检查中，具有高灵敏度、高特异性、稳定快速、操作简单等优点。

血清学方法：结核杆菌抗体在血清中的含量随疾病加剧而上升,疾病缓解而降低。因此测定其抗体水平不但可辅助诊断肺结核,而且还可成为评估肺结核治疗与转归的重要指标之一,对菌阴活动性结核病亦有一定辅助治疗价值。而是否选用的是较好的包被性抗原也是提高检测出敏感度的一个重要环节。整个检测过程只需数分钟,且操作简便,不需专门仪器设备和技术培训,可用肉眼直接判断结果,不失为实用的结核病检查的过筛试验,值得广泛推广。

噬菌体生物发光技术：检测活的噬菌体在活菌体内增殖后所表达的荧光素酶的含量,通过检测发光的强度就可对噬菌体进行定性和定量分析,从而定性或定量的分析相应的分支杆 菌存活及其数量。另外此方法药敏试验结果的时间仅为72h ,大大缩短了时间。这些优点充分说明分支杆菌噬菌体用于结核杆菌的快速检测和药敏试验有较大的应用前景,在抗结核新药的筛选上也有应用价值。