结核杆菌及其耐药性快速检测

结核杆菌及其耐药性快速检测

刘光艳

眉山市人民医院 四川眉山 620010

一、结核杆菌及其检测方法介绍

结核分枝杆菌，又被称作结核杆菌，它是引发结核病的病原细菌。主要通过呼吸系统结核患者传播，能够侵犯全身各个器官，最常见的为肺结核。

根据世界卫生组织的估算，全球每年增加的结核病人大约在800万左右，死于结核病的人大约在300万左右，全世界人口的三分之一，也就是大约17亿人曾经感染过结核杆菌。在发展中国家，目前结核病的发病概率依然在持续地上升，在发达国家的病人也是有所上升的，比较常见于高危人群中（比如慢性酒精中毒的人、感染过HIV的病人、滥用药物的人以及无家可归的人）。

在控制结核的过程中，建立敏感、快速、特异的检测结核杆菌的手段具有非常重大的现实意义。直到目前为止，结核的诊断依然主要依靠透视检查、临床症状、痰标本镜下检查、结核菌素试验或者痰标本结核杆菌培养等。通过临床症状以及透视检查不能够发现早期的结核病人，并且特异性不是很强；结核菌素试验的特异性不是很强，阳性也只能说明在以前有否暴露在分枝杆菌下；痰标本镜检的敏感性和特异性也不能达到要求；培养的方法来分离结核杆菌是判断结核的重要标准，但是常规的培养方法需要的时间比较长，一般需要几个周的时间。近年来，结核杆菌（包括牛型、人型、非洲型）在快速检测方面取得了快速的发展，主要包括基因扩增技术和改良液体培养方法。

建立准确、快速的耐药性检测方法，能够有效指导并制定科学合理的治疗方式，及时判断治疗是否成功，并且是否产生了耐药性，也有利于展开大规模的结核杆菌的耐药性调查。之前基于培养方法来检测结核杆菌的耐药性，耗时比较长，并且结果不一定准确，这些年来，耐药性的快速检测方法已经取得了较大的进展，大体包括：噬菌体检测方法、改良液体培养方法以及基因检测方法等。

二、结核杆菌的快速检测方法

（一）改良液体培养方法

这些年来，已经建立了多种多样的改良液体培养方法，大大缩短了培养所需要的时间，这类的试剂盒包括了Bactec 9000MB、Bactec 460TB以及MGIT等。Bactec 460TB试剂盒是应用比较早的试剂盒，采用的是放射测量方法；Bactec 9000MB以及MGIT试剂盒采用的是荧光检测方法，很好的避免了放射性的危害，以上这些方法的检测时间基本上在8-10天，经过大量的标本验证，采用以上这些方法进行检测，其结核杆菌阳性概率不一定比平板培养的方法低，然而，这些方法费用相对较高，因为标本污染所导致的假阳性的概率也比平板方法要高，需要采取非常严格的质控措施来防止发生污染。

（二）基因扩增技术

在临床上用于结核杆菌基因扩增技术主要有两类：其一，需要温度循环方法：转录依赖、聚合酶链反应的扩增系统与连接酶链反应；其二，等温系统：Qβ复制酶系统、链替代扩增反应以及循环探针反应。聚合酶链反应是目前应用最为广泛的，主要包括套式（半套式）PCR、单基因PCR、多基因PCR以及逆转录PCR。上面提到的方法，从拿到标本到检测出结果，大约需要3-6小时，能够检测出结核杆菌10-100CFU，在临床上得到了非常广泛的应用。

1、扩增靶基因的选择

基因扩增技术中选择扩增靶基因也是非常重要的。扩增靶基因通常主要包括：IS6110基因、rRNA基因、mtp40基因以及MIRU基因。

2、模板的制备

临床上，检测结核杆菌用的标本主要是痰标本，另外还有尿液、血液以及支气管灌洗液等。应该尽可能去除检验标本当中的抑制物，使得结核杆菌染色体的DNA能够释放出来，这是确保检测成功的很重要的因素之一。模板的制备方法比较多，以下两种方法是比较常用，并且效果比较好的方法。

（1）常规标准裂解法

首先把标本用乙酰半胱氨酸消化液进行消化、离心、再沉淀，经过SDS与蛋白酶K裂解液裂解之后，酚与氯仿抽提，然后乙醇沉淀染色体DNA，由于标本里一般模板的量比较少，为了减少模板的损失，可以适当加入鲑鱼精DNA来共同沉淀。假如要提取RNA的haul，那么使用酸性酚与氯仿抽提，在沉淀的时候适量加入转运RNA来共同沉淀。上面的方法提取出来的模板基本上是不含有抑制物的，DNA释放完全，但是步骤比较麻烦，需要花费的时间比较长，还会增加污染的机会。

（2）快速制备法

快速制备法式标本经过NALC与4%NaOH消化、离心，弃上清、沉淀使用TE缓冲液来洗涤两至三次，使得PH值将到8.0，并且减少标本里的抑制物。在沉淀里加入Tri-tonX-100裂解液，100℃15分钟，离心之后取出上清液备用。

三、耐药性的快速检测

（一）改良液体培养的方法

培养方法来检测耐药性通常包括：抗性比率法、绝对浓度法以及比例法。目前，比例法已经被WHO推荐成标准药敏方法，但是以前采用的方法相对比较费时，不能够进行准确定量，并且仅能对结核杆菌的培养物进行分析。这些年来，改良的液体培养方法不仅用于检测，还用于耐药性的检测，为了能够加快实验的进程，可以对涂片经抗酸染色检查阳性的一些标本直接开展药敏实验，仅需要7-14天就能够得到结果，并且能够准确定量，然而，这些方法的费用比较高。

（二）噬菌体检测的方法

目前构建的lux或者荧虫素酶基因的分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体能够以特异性来感染分枝杆菌，产生溶源状态，并且展开荧虫素酶基因的表达。后来，有人又构建了另一种噬菌体，并且建立了PhaB实验。把噬菌体感染等待检测的结核杆菌，当噬菌体进入到活的菌体后，再采用一种比较特殊的化学手段把没有进入到菌体的噬菌体灭活，对于已经进入到活菌体的噬菌体不会产生影响。

（三）基因检测方法

临床上目前治疗结核的药品主要有：异烟肼、乙胺丁醇、利福平、链霉素等等。有专家已经对这些药物所作用的靶位及导致抗性产生的基因突变位点等方面进行了相关的研究。目前，主要使用的是PCR方法。

随着对结核杆菌的不断深入研究，新的检测方法也在不断出现，每种检测方法都有其独有的特点，也或多或少存在着一些缺陷。伴随着结核病在临床发展的需要，可以从传统试验法到现代实验法，从菌体水平到分子水平，来展开全视角的探索和研究，从不同深度、不同层次来进行完善和发展，这样才能够为控制结核病提供理想的手段。