抗体-药物偶联物（ADC）生物标志物在结直肠癌中的表达

抗体-药物偶联物（ADC）生物标志物在结直肠癌中的表达

张晶晶1,孙西予2,马婷2,赵凤毅*1,2

上海韵祥医学科技有限公司  上海市嘉定区翔乐路28号3号楼，邮编201802

1.浙江大学滨海产业技术研究院  天津市滨海高新区高新六路39号2号楼  邮编300451

摘要：结直肠癌(CRC)是仅次于肺癌的第三种最常见的癌症，也是第二大致命癌症。传统化疗药具有较差的药代动力学，治疗窗口低，特异性差，对正常细胞有毒性作用；而抗体-药物偶联物（Antibody–Drµg Conjµgates ADCs)药物可以弥补这些缺点，多个 ADCs药物正在进行结直肠癌 (CRC) 的临床试验；本研究提供了一种可以快速检测人体内肿瘤药物靶点蛋白表达量的质谱方法，可以准确定量72种蛋白在肿瘤组织种的表达量，采用本方法对355名结直肠癌患者进行72种肿瘤药物靶点蛋白表达量的检测；通过数据分析，在CRC 患者中找到9组ADCs药物受体靶点生物标志物组。本研究结果表明，CRC的ADCs药物治疗具有可变表达模式的蛋白质生物标志物组合，为CRC的ADCs药物的研发提供临床数据支持。

关键词：结直肠癌，抗体-药物偶联物，生物标志物，质谱，定量

恶性肿瘤是世界上死亡率排第二的疾病，结直肠癌(CRC)是仅次于肺癌的第三种最常见的癌症，也是第二大致命性癌症。目前，CRC 5年总存活率约为60%，转移性结直肠癌(mCRC)的5年总存活率则降至10%左右[1]。在早期诊断的病例中，手术或联合化疗和放疗仍然是优先的治疗选择，然而手术对晚期CRC不再有效，细胞毒疗法的疗效也可能会因为抗药性的快速演变和癌症的复发而失效。在这些治疗中，化疗可以单独使用治疗肿瘤，也可以与手术联合使用，或与放疗联合使用，是频率最高的治疗选择。新辅助化疗（Neoadjuvant）是在手术前或者放疗前联合化疗，以期缩小肿瘤。辅助化疗（adjuvant）是在手术后或者放疗后使用化疗，以杀灭可能残留的肿瘤细胞。传统的化疗药由于有较差的药代动力学，治疗窗口（therapeutic window）很低。而且，化疗药物并非特异性针对肿瘤细胞，对正常细胞也有毒性作用，因此脱靶效应（Off-Target）很明显[1,2]。

而抗体-药物偶联物（Antibody–Drµg Conjµgates ADCs)药物可以弥补这些缺点。ADCs药物是由抗体（antibodies）通过连接子（linkers）结合细胞毒性药物（弹头 Payload/Warhead）组成。ADCs药物在循环中需要处于稳定状态，可以被认为是一种前药（prodrµg），药物结合靶点后，内吞入细胞，通常在溶酶体释放细胞毒药物，进行肿瘤细胞杀伤作用。由于抗体靶向性强，携带负载药物的细胞毒性效能很高，次纳摩尔的半数最大抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration IC50）就可以用来衡量负载药物的毒性了[3,4]。

抗体偶联药物（Antibody-Drµg Conjµgates，ADCs）是一类由单克隆抗体和具有强效细胞毒性的小分子药物通过生物活性连接子偶联而成的新型生物药物。其药物作用机理为通过单克隆抗体特异导向靶标癌细胞，再由偶联的小分子药物杀死癌细胞[3,4]。因此，ADC兼具了单克隆抗体药物高度特异性和靶向性的特点，以及小分子药物清除癌细胞的高效性，能协同发挥抗体药物和化学药物各自的优点，能够降低对生物系统的伤害。

在上世纪60年代就有文献报道ADCs药物用于动物模型，到80年代就有鼠原抗体的ADCs药物进行临床试验，第一个ADCs药物是2000年批准的gemtuzµmab ozogamicin GO (developed by Wyeth)，靶点为CD33，负载药物为卡里奇霉素(Calicheamicin)，用来治疗急性髓样淋巴瘤（acute myeloid leukaemia AML），然而在随后的批准后研究中发现GO联合化疗药不能有效提高生存时间，而且相对于单用化疗有更高的致命毒性，在2010年，由辉瑞（辉瑞收购了Wyeth）自行撤离市场，此药没有在欧洲批准。随后，2011年Seattle Genetics/武田的Adcetris (brentuximab vedotin 靶向CD30)和2013年罗氏旗下Genetch的Kadcyla（trastuzµmab emtansine 靶向HER2）被美国FDA及欧洲EMA批准上市[2,5]。之后，ADCs药物的研发不愠不火，大概有30多个ADCs药物进入临床试验。至今已有4个ADCs药物被美国FDA及欧洲EMA批准，还有个治疗三阴性乳腺癌（TNBC）药物sacituzµmab govitecan（由Immunomedics公司研发），临床数据很不错，但由于CMC的问题，目前尚未被FDA批准。目前有超过70个ADCs候选药物进行临床试验。第一代、第二代、第三代ADCs药物不断的技术迭代，更同质性、更稳定、杀伤效能更高的药物研发不断出现[3,4,5]。

2022年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会已圆满落幕，大会中结直肠癌治疗迎来众多新进展，尤其是针对局部晚期错配修复缺陷直肠癌的免疫单药治疗实现了里程碑式突破，错配修复缺陷直肠癌是一种常见的直肠癌类型，约占所有直肠癌的5%-10%。此前，研究人员发现错配修复缺陷转移性结直肠癌对PD-1阻断剂有反应，因此研究人员推测，局部晚期错配修复缺陷结直肠癌或许可以在免疫治疗后获得良好的预后。为此，美国纽约Memorial Sloan Kettering肿瘤中心的研究团队开展了一项PD-1抑制剂Dostarlimab治疗II期和III期错配修复缺陷直肠腺癌患者的临床研究。结果证实，通过Dostarlimab治疗，局部晚期直肠癌患者得到完全缓解。该研究纳入了12例II期和III期错配修复缺陷直肠腺癌患者，在仅采用Dostarlimab治疗后进行了不低于6个月的随访（6-25个月），结果显示，100%的患者均达到临床完全缓解，在MRI、FDG-PET、电子可视化内镜、直肠指检或活检均无肿瘤迹象，且在随访期间并未出现任何复发迹象。此前，一般认为RAS（KRAS/NRAS） 野生型转移性结直肠癌 (mCRC) 患者的一线治疗通常是基于 5-氟尿嘧啶的化疗与贝伐珠单抗或抗表皮生长因子受体 (EGFR)，但是选择哪种单克隆抗体的效果更好却并没有定论。为此，日本研究者进行了一项开放标签、多中心试验（PARADIGM试验）针对RAS野生型转移性结直肠癌采用EGFR抑制剂Vectibix(panitµmµmab，帕尼单抗）或Avastin（Bevacizµmab,贝伐珠单抗）联合标准一线化疗（mFOLFOX6）的效果进行了对比。该研究纳入了未接受过化疗的RAS野生型转移性结直肠癌患者，结果显示，与贝伐珠单抗相比，帕尼单抗联合mFOLFOX6显著改善RAS野生型和左侧原发肿瘤mCRC患者的总生存期，且提高了患者的缓解率和R0切除率，为该人群建立了标准的一线联合方案。总而言之，ASCO 2022年会中公布的多项针对结直肠癌的研究有望改变结直肠癌治疗的格局，免疫单药治疗错配修复缺陷直肠癌实现100%缓解的研究，将成为局部晚期直肠癌治疗的里程碑，有望改变局部晚期直肠癌的治疗标准。

基于抗体药物的研发，多个ADCs药物正在进行结直肠癌 (CRC) 的临床试验，由于ADCs药物的独特机制，患者选择不仅应包括筛选是否存在靶标抗体，还应包括筛选是否存在任何抗性标志物或对有效载荷的响应。本研究提供了一种可以一次性快速检测人体内肿瘤药物靶点蛋白表达量的质谱方法，特异性针对72种肿瘤药物靶点，并可以准确定量这72种蛋白在肿瘤患者体内的表达量；采用本方法对355名结直肠癌患者进行检测，在FFPE 肿瘤组织中建立了ADCs药物抗体靶点生物标志物组，可同时量化抗体靶标的蛋白质水平以及有效载荷标志物。本研究揭示了可能影响结直肠ADCs药物治疗反应的具有可变表达模式的蛋白质生物标志物。

材料与方法

（1）样本信息

355 名临床CRC患者的FFPE肿瘤组织切片（2片）；第1片4µm，用于HE染色；第2片10µm，用于抗体靶点蛋白质谱检测。

（2）样本前处理

样本切割

每个样本分别取上述的4µm和10µm厚的FFPE切片，行苏木精和伊红染色，脱蜡处理。数字病理扫描系统（3DHistech,MIDI）将H&E切片和10µm切片扫描成像，并请病理专家在图像上对特定的肿瘤细胞区域进行标记，确保单片肿瘤细胞标记区域面积大于8 mm2，以满足最低检测下限肿瘤细胞个数。把切片放置在激光显微切割仪（Nikon , eclipse Ni-U）载物台上，将已标记的图像导入仪器系统，进行激光显微切割，利用激光能量将肿瘤细胞从载玻片上分离收集细胞[6]。

肿瘤细胞裂解与肽的提取

切割后的肿瘤细胞干燥，加入一定量的组织裂解液（Ammoniµm Bicarbonate Buffer,Sigma Aldrich,S2454-200ML），孵育1.5小时，加入胰蛋白酶（Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega, V5111），过夜酶解后，终止酶解反应[6]。采用微量BCA方法(Micro BCA, Thermo Fisher Scientific, 23231)检测酶解液中肽段的浓度。

质谱样本前处理

每个样品加入已知浓度的同位素标记的重肽作为内标，用于定量内源蛋白质的内标，将1µg样品注入连接三重四极杆质谱仪(Thermo,TSQ-Altis)的液相色谱仪(Waters,ACQUITY UPLC M-Class System)，用于抗体靶点蛋白的质谱定量检测[6]。

（3）抗体靶点蛋白的质谱定量检测方法

抗体靶点蛋白的质谱定量检测采用液质联用仪。液相色谱仪型号: Waters ACQUITY UPLC M-Class System，质谱仪型号：Thermo TSQ-Altis。

液相方法：采用梯度洗脱法。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液（Thermo Scientific，LS118），流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液（Thermo Scientific，LS120）。色谱柱为捕集柱（nanoEase MZ Symmetry C18 Trap Column, 100A, 5 µm 180 µm x 20mm）和分析柱（nanoEase MZ HSS T3 Column, 100Å, 1.8 µm, 100 µm x 100 mm）。

质谱方法：Thermo TSQ-Altis质谱仪在正极NSI模式下运行，质谱仪参数设置：SRM扫描模式、正极、电喷雾电压(2.3 kV)、碰撞气（2mTorr）。

图1 : FFPE切片肿瘤组织中抗体靶点蛋白质谱定量检测流程图

（4）质谱数据采集与处理

质谱数据通过使用Pinnacle Production软件进行数据处理(版本号：V1.0.83.0)，根据内源多肽和合成重肽的峰面积，绝对定量肿瘤细胞表达的抗体靶点蛋白的量，含量（amol）= 轻肽的峰面积/重肽的峰面积×5000amol[6,7]。

（5）统计学策略与统计学处理方法

临床调查人员收集并提供样本患者的临床信息，通过讨论确定基本特征和变量。除收集相关临床信息外，统计分析数据中将加入抗体靶点蛋白的质谱检测的实验结果。研究对象基线资料统计使用R 1.3.1093版本对数据进行分析。

结果与讨论

（1）以HER2为受体靶点的ADCs药物患者反应的研究

我们检测了355个CRC患者肿瘤组织中HER2蛋白的表达量[7~11]以及化疗药物反应靶点TOPO1和TUBB3的表达量，图2（A）展示了，受体靶点HER2表达量与化疗药物反应靶点TOPO1表达量的分布图，当 TOPO1表达量大于1350amol/µg时，患者对药物反应明显；图2（B）展示了，抗体靶点HER2表达量与化疗药物反应靶点TUBB3表达量的分布图，当TUBB3表达量大于750amol/µg时，患者对药物反应表现为抵抗，药物可能不起作用；结合图2（A）和图2（B）的结果，将3这结合分析，图2（C）为3个靶点蛋白多重分析结果，1）当HER2蛋白表达量小于300amol/µg时或HER2蛋白表达量大于300amol/µg，TOPO1表达量小于1350amol/µg且TUBB3表达量大于750amol/µg时，预测患者对HER2/TOPO1和HER2/TUBB3 ADC的反应均可能无效；2）当HER2蛋白表达量大于300amol/µg，TOPO1表达量大于1350amol/µg且TUBB3表达量大于750amol/µg时，预测患者对HER2/TOPO1 ADC的反应可能有效；3）当HER2蛋白表达量大于300amol/µg，TOPO1表达量小于1350amol/µg且TUBB3表达量小于750amol/µg时，预测患者对HER2/TUBB3 ADC的反应可能有效；4）HER2蛋白表达量大于300amol/µg， TOPO1表达量大于1350amol/µg且TUBB3表达量小于750amol/µg时，预测患者对HER2/TOPO1和HER2/TUBB3 ADC的反应均有效；

图 2. HER2 ADC 靶点的表达分布。 (A) CRC 患者 (n=355) 中的 HER2 表达和 TOPO1（有效载荷反应生物标志物）表达。 参考截止值 1350 amol/µg（第75个百分位），用虚线表示。 (B) CRC (n=298) 中的 HER2 表达和 TUBB3（有效负载抗性生物标志物）表达。 参考截止值 750 amol/µg 用虚线表示。 (C) HER2、TOPO1 和 TUBB3 蛋白表达的联合靶向蛋白质组学分析。 多重蛋白表达模型可以揭示抗体靶点表达水平 (HER2) 的反应和耐药机制。

（2）除HER2外，其他ADCs药物受体靶点蛋白表达量的研究

除HER2外，我们还特别关注Trop2、FRalpha、MSLN以及HER3 4种ADCs药物靶向蛋白的表达水平，图3显示，这4种蛋白在CRC患者肿瘤组织中，都有不同程度的阳性表达：Trop2 (59.8%) 、FRalpha(3.7%)、MSLN(26.5%)、HER3(21.5%)。

图 3. ADC 受体靶点的表达分布。 （A）Trop2 表达分布（灰点）。 具有 TOPO1 表达 >1350amol/µg 的 Trop2 阳性 CRC 用橙色圆点表示。 (B) FRalpha 表达式分布 (灰点)。 蓝点代表 FRalpha 阳性，TUBB3 表达低于临床截止值。 (C) MSLN 表达式分布 (灰点)。 绿点代表 MSLN 阳性，TUBB3 表达低于临床截止值。 (D) HER3 表达分布（灰点）。 TOPO1 表达 >1350amol/µg 的 HER3 阳性 CRC 用紫色圆点表示。

（3）大肠癌中潜在ADCs生物标志物的表达分布

选择EGFR[7,11], HER2[7,11], HER3[7,11], AXL, Mesothelin, FR-alpha, Trop2蛋白为受体靶点研究对象，选择TOPO1 和 tubulin-beta3为药物敏感性反应蛋白，分析找到9种潜在ADCs生物标志物组合并计算其在CRC患者中的有效反应率：1）HER2(+), TOPO1(>1350)；2) HER2(+), TUBB3(-);3) HER3(+), TOPO1(>1350);4) HER3(+), TUBB3(-);5）EGFR(+), TUBB3(-)；6）Axl(+), TUBB3(-)；7）Mesothelin(+), TUBB3(-)；8）FRalpha(+), TUBB3(-)；9）Trop2(+), TOPO1(>1350)；

结论

本研究对355例CRC患者的FFPE肿瘤组织进行多重质谱法定量蛋白质组学分析，分别对72 种蛋白质生物标志物进行量化分析。研究发现HER2 蛋白在 1.4% 的 CRC患者中存在过表达，所以本研究以HER2为受体靶点，并将其他受体靶点以及药物反应蛋白靶点作为研究对象；靶向蛋白质组学检测到不同的抗体靶点在 CRC种的表达水平：EGFR(83%)、HER2(52%)、HER3(21.5%)、Axl(3.7%)、间皮素(26.5%)、FRalpha(3.7%)和Trop2 (59.8%) ；多重质谱分析同时量化了2种已知药物敏感性反应蛋白，虽然第 75 个百分位用于定义 TOPO1 过表达，但较低的百分位截止值也可用于 ADCs，例如TUBB3低表达。本研究结果表明，CRC的ADCs药物治疗具有可变表达模式的蛋白质生物标志物组合，为CRC的ADCs药物的研发提供临床数据支持。

致谢

该研究由上海市科学技术委员会资助上海韵祥医学科技有限公司（项目号：18401933401）和浙江大学滨海产业技术研究院（项目号：BHXQKJXM-PT-ZJDXBHYJY-2017001）基金支持。

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第一作者：张晶晶（女、硕士、出生日期1990-08-23）邮箱：zhangjingjing@51yunjian.com

*通讯作者：赵凤毅（男、主任技师、出生日期1954-12-20） 邮箱：zhaofengyi@51yunjian.com