黄瓜根际促生菌的分离筛选及促生效果测试

黄瓜根际促生菌的分离筛选及促生效果测试

苏善高, ,邹林君, 阙庆演 ,谭文邦, 甘敏鑫*

( 南宁汉和生物科技股份有限公司 , 广西　南宁　530007)

摘要：植物根际促生菌（PGPR）是定殖在植物根际并且能够促进植物生长发育的一类有益细菌，本研究从南宁市武鸣区黄瓜根际土和黄瓜根系中筛选出2株具有产IAA能力的菌株，分别命名为HH01和HH02。定量分析测定其产IAA能力，通过盆栽试验验证其促生能力。结果显示，菌株HH01和HH02产IAA浓度分别达到141mg/L和93mg/L；2株菌对黄瓜地上部分生长存在显著促进作用，其中HH01较HH02提苗促生长效果更好。本研究筛选出的优良PGPR菌株，可为今后生物菌肥推广应用提供菌种资源。

关键词：黄瓜；植物根际促生菌（PGPR）；IAA；盆栽试验；促生效果

在农业生产中，植物生长所必需的各种营养元素，除来自于大气、水、土壤供应之外，主要通过施肥来提供，农作物的增产有50%依赖于化肥。然而，近些年为了追求高产及高效益，我国农业生产普遍存在化肥使用超量情况。化肥的不合理施用，导致土壤性状恶化、养分比例失衡，农产品品质下降，同时生态环境被破坏。因此，从农业可持续发展及保护生态环境等方面综合考虑，生物菌肥与化学肥料配施是提高土壤质量、改善生物多样性（主要为土壤微生物）和农产品品质的重要途径。[1]植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。植物根际促生菌促进植物生长的机理较多，大体上可以通过直接和间接2 个方面对植物起作用。PGPR 直接促进植物生长指的是某些植物根际促生菌可合成某些对植物生长发育有直接作用的物质(如生长素等)和(或)改变土壤中某些无效元素的形态，使之有效化而利于植物吸收(如固氮、解磷等)。间接作用指的是某些植物根际促生菌抑制或减轻某些植物病害对植物生长发育和产量的不良影响。[2]

本试验从黄瓜植株根际土和黄瓜根系中筛选出具有明显促生效果的功能性菌株2株，通过盆栽试验，验证促生菌株对黄瓜的促生效果，为筛选适宜本地的微生物肥料提供优良菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：植物根际样品采自南宁市武鸣区某黄瓜大棚种植地，选择长期施用农家肥和化肥施用量较多的区域进行采样，将根际尽量完整采集，分别装入无菌自封袋中，标注植物名称及采集日期，放置于冰盒中迅速带回实验室进行菌株分离，获得PGPR菌株。

1.2 试验所用培养基

固体培养基：葡萄糖5g、胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0；

液体培养基：固体培养基中不添加琼脂。

King氏液体培养基：蛋白胨20g、K2HPO4 1.15g、MgSO4·7H2O 1.5g、丙三醇 15 mL、L-色氨酸0.1g（或不加色氨酸）、蒸馏水1L，pH7.2；

S2比色液：FeCl3 4.5g，10.8mol/L的H2SO4 1L

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离纯化

称取10g黄瓜根际土壤样品于10mL无菌水中，30℃摇床震荡30min，震荡完成后静止20min，吸取上清液，将上清液制备成10-1至10-5梯度的样品，取10-3至10-53个稀释梯度的样品各100 μL，分别涂布于固体培养基上；30℃恒温培养2d，随机挑取50株细菌，并通过平板划线法分离纯化，直至得到纯的菌株，挑取单菌落，接种于液体培养基中， 35℃，200rpm，摇床恒温震荡培养36h后，加甘油保存至-80℃冰箱。

同时取黄瓜根系0.5g，用75%酒精表面消毒30s，用无菌水冲洗3次；将根系剪碎置于无菌研钵中，加入1 mL无菌水研磨匀浆，静置15 min后再用无菌水进行梯度稀释；取100μL各梯度稀释液分别涂布于固体培养基上，35℃恒温培养箱培养48 h，挑取30株单菌落，接种于液体培养基中，35℃，200rpm摇床恒温震荡培养30 h后，加甘油保存至-40℃冰箱。

1.2.2 IAA检测：

测定方法为定性显色法和Salkowski定量比色法。[3]

定性测定：将2株 PGPR菌株分别接种于50mL King氏液体培养基中，每菌株3次重复，以不接菌培养基为对照，35℃、200rpm条件下振荡培养2d。吸取各菌液100µL于白瓷板上，加等体积Spot比色液，其中对照加100µL 3-吲哚乙酸，每处理3次重复，将白瓷板放置于室温黑暗条件下，20 min内观察并记录颜色变化。如变为粉红色即能分泌IAA，浅粉色即分泌IAA能力弱，没有颜色变化即为不能分泌IAA。

定量测定：利用Salkowaki比色法对分离获得的2株PGPR菌株分泌IAA特性进行测定。吸取以上各菌株培养液10mL，于4℃、10000rpm条件下离心20 min，吸取上清液5 mL，并加等体积的S2比色液，在黑暗条件下放置30min，测定波长530nm处各培养液的吸光度值，通过制作的标准曲线计算测定样品的IAA浓度。

1.2.3 黄瓜盆栽促生试验

采取盆栽培育黄瓜幼苗的方法，具体步骤为：将基质土混匀分装置花盆中，每盆装土约1Kg。同时将供试菌株经平板纯化后接入50mL液体培养基中，35℃，200rpm振荡，培养8h，以5%的比例接种至100mL液体培养基中，同样培养条件下培养48h后备用。试验采用顺序区组排列，土培种植黄瓜苗，2叶1心移栽到花盆，进行定根水样品处理，设置7个处理，每个处理设7个重复，共49株苗。其中，HH01使用倍数为100倍，200倍，400倍，800倍；HH02使用倍数为100倍，200倍，400倍。定根水处理后，间隔4-8天使用1次处理液，共使用3次。调查指标为地上部分的鲜重和干重。

2 结果与分析

2.1 菌株IAA产量测定

在分离纯化的80株根际细菌及根际内生菌中，经测定，在不加色氨酸的King氏液体培养基中，有5株具有产IAA功能。其中产生量最高的2株菌分别命名为HH01和HH02，其IAA产生量分别达到141mg/L和93mg/L，这2株菌将作为本试验的目标菌株开展进一步促生能力验证。

2.2 促生菌对盆栽黄瓜生长的影响

HH01对地上部分的促生长效果呈现随着浓度增加促生长效果先增加后降低的规律。除100倍处理与对照无显著差异外，800倍-200倍处理对地上部分生长存在显著促进作用，且以400倍处理效果最优，400倍处理的地上部分干重与200倍处理之前存在显著差异；其中800倍和400倍处理的鲜重和干重较对照高17.81%-33.29%不等，达极显著水平，200倍处理的鲜重和干重较对照分别高13.87%和15.47%。

HH02的各浓度处理中仅200倍处理与对照相比存在显著促进作用，400倍和100倍处理与对照无显著差异。400倍和200倍处理鲜重和干重较对照高5.39%-17.72%不等，200倍处理与400倍处理之间差异不显著。对应各浓度对地上部分的促长效果HH01整体优于HH02。其中HH01的400倍处理的促生长效果显著大于HH02的200倍处理。

3 讨论

IAA作为一种刺激植物生长的激素类物质，广泛的应用于农业生产中，在一定的浓度范围内能促进植物的生长，浓度过高反而会抑制生长。

本研究从南宁市武鸣区黄瓜根际土和黄瓜根系中分离纯化出80株细菌。通过进一步对其产物IAA进行定性定量检测，得到产IAA浓度分别达到141mg/L和93mg/L的两株菌，并命名为HH01和HH02。通过盆栽实验验证了其促生能力，其中HH01在稀释400倍时，极显著促进地上部生长，湿重较CK提高30.22%；干重较CK提高33.29%。HH01菌株可以用于后续 PGPR 微生物肥料的研制和相关研究。

[1]杨蓉, 房世杰, 杨文琦,等. 植物根际促生细菌(PGPR)分离筛选与鉴定[J]. 植物保护学报 Journal of Plant Protection，2018，45（4）：836-845

[2]KLOEPPER J W． Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity [J]． Trends Biotechnol，1989，7: 39 －44．

[3]Senthilkumar M，Madhaiyan M，Sundaram S，et al. Intercellular colonization and growth promoting effects of Methylobacteri⁃um sp. with plant-growth regulators on rice（Oryzasativa L. Cv CO-43）. Microbiological Research，2009，164（1）：92-104.

作者简介：苏善高（19-），男，主要从事微生物发酵工作；

通信作者：甘敏鑫，（1985-），女，工程师，微生物发酵工作;