菠萝蛋白酶药效学研究概况

 菠萝蛋白酶药效学研究概况

刘小兰1蒋林波2

 广东彼迪药业有限公司，广东开平市 529331

摘要：菠萝蛋白酶是从凤梨属植物菠萝中提取的一组复合巯基蛋白水解酶。已有大量的研究证实，菠萝蛋白酶具有抗炎、抗血栓、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等作用，与其它药物配合使用时具有增效作用，在治疗各种炎症、心脑血管疾病、癌症、烧伤及呼吸道疾病等方面，有广阔的应用前景。作者综述了历年来国外菠萝蛋白酶的主要药效学研究成果，旨在为菠萝蛋白酶制剂的开发应用提供参考。

关键词：菠萝蛋白酶；药学研究

引言

菠萝蛋白酶(Bromelain，以下简称BR)是从菠萝[Ananas comosus (L.) Merr.]植株中提取的一类蛋白水解酶的总称。1876年Peckold等在巴西菠萝中发现含有蛋白酶，Chittenden 于1891从菠萝汁中分离出BR，直至Heinecke于1957年在菠萝的茎中发现含有更多的BR后，BR始得以商业化规模生产。从菠萝的果实中提取的称为果菠萝蛋白酶(Fruit Bromelain)，从菠萝的茎中提取的称为茎菠萝蛋白酶(Stem Bromelain)。

BR的分子量约为 33000，是典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质，肽，酯，酰胺，因而在医药和食品领域有很高的应用价值。我国于上世纪80年代将BR制剂作为药物正式用于临床，并正式纳入药品标准。国内外的研究发现，BR不仅具有抗炎作用，抗血栓、抗肿瘤、抗病毒等作用，还有免疫调节功能，可用于治疗各种炎症、皮肤烧伤、上呼吸道感染和心血管疾病，并能抑制肿瘤细胞生长。近期的研究表明，BR在治疗CoVID-19方面也有一定发展前景。

本文仅对BR的药效学研究概况作一综述，以期能对BR制剂的开发提供参考。

1、抗炎作用

动物试验表明，BR具有抗炎作用。Laura P. Hale等报导，BR可能通过多种机制发挥抗炎作用，包括改变白细胞的迁移和激活。David J等人也证实，在3种不同的白细胞迁移到发炎的腹膜腔的小鼠模型中，BR均能有效地减少中性粒细胞向急性炎症部位的迁移，从而减少对炎症刺激的急性反应。Bakare Ahmed O的研究表明， BR还可对抗促炎介质（Pro-inflammatory mediators），显著改善结扎Wistar大鼠神经病理性疼痛(NP )的基本体征。

其临床应用研究方面，MAURER在BR增加中性粒细胞白细胞介素-8（IL-8）分泌的能力研究的基础上，公开了BR治疗炎性疾病和用于伤口愈合过程辅助治疗的用途发明专利。KLING [7]采用蛋白酶组合物调节存在于伤口和炎症部位的蛋白质的水平和活性，并促进受损组织的修复。Michelini S等的研究表明，受试者服用BR、香豆素和芦丁对临床控制I和II阶段的原发和继发性淋巴水肿和控制与慢性炎症方面均有帮助，且无副作用，肝功能参数也无改变。Naeem Hira等采用BR+醋氯芬酸治疗腰椎骨性关节炎(low back pain，LBP)，与单独使用标准药物醋氯芬酸作为对照，使用酶补充剂6周可产生有益的延滞效应（carry-over effects），而对骨髓指数（bone marrow index）和生命体征无影响，生活质量明显改善。 MIZUNO HIROYUK将BR 作为抗炎酶与镇咳、袪痰药、支气管扩张剂、抗组胺药或植物成分药等若干种药物组合在一起，用于治疗普通感冒，改善症状。KASTKE, FLOYD A将槲皮素与BR混合作为主要活性成分，治疗非细菌性前列腺炎，可有效增加肠道透壁吸收，显著地提高了槲皮素的生物利用度。Wittenborg A等的流行病学研究也表明，在治疗关节疾病、脊柱疾病、风湿性软组织疾病等方面，含BR、胰蛋白酶、芸香苷的组合物比类固醇消炎药的疗效和安全性更好。

2、免疫调节作用

Christian R. Engwerda研究证实，BR在体外可以激活小鼠巨噬细胞和自然杀伤细胞(Natural Killer Cells,NK)。实验中还观察到，BR可增加NK细胞对白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-12（IL-12）介导的Ⅱ型干扰素(IFN-γ)的产生，还可以增强IFN-γ介导的一氧化氮和巨噬细胞对肿瘤坏死因子(TNFα)的产生，其作用与内毒素受体的激活和IFN-γ受体的调节无关。因此，BR有可能在免疫缺陷的情况下激活炎症反应。他们在脾细胞培养中体内外的研究结果还表明,  BR可以通过对辅助细胞(accessory cell)的刺激和对T细胞的直接抑制, 增强和抑制T细胞的免疫反应。Hale等 观察到，BR作为植物蛋白酶活性抗原，可以通过多次刺激系统和粘膜的免疫反应，而这种免疫反应的机制，可能有助于开发新的口服疫苗的佐剂。Brakebush 等也报道BR具有免疫刺激特性，是一种促进吞噬、呼吸破裂和被人类粒细胞和单核细胞杀死白念珠菌的加速剂，恶性免疫淋球蛋白血症(XLA)患者的吞噬细胞似乎特别容易受到这种刺激。BR还可减少炎性疾病的发作和持续时间，并改善伤口愈合过程中的状况。其抗炎作用主要是由于免疫系统细胞的分泌增加，白细胞介素-8（IL-8）分泌刺激炎症区域的免疫反应，并通过趋化过程将免疫细胞吸引到该区域。

3、防治心血管疾病

Metxig C等的实验证明，BR粗提物在体外可减少人体血小板聚集，减少血小板在牛主动脉内皮细胞的吸附和大鼠体内血栓的形成。

JOLLY, JAMES F在其研究成果中认为，高水平的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)会降低纤维蛋白溶解，导致血栓形成。而有效剂量的BR可抑制PAI-1活性，从而起到治疗心血管疾病的作用。因此，BR作为一种蛋白水解酶，加速纤维蛋白原的分解对心血管疾病的防治是有益的，它能抑制血小板聚集引起的心脏病发作和中风，缓解心绞痛症状。

4、治疗癌症

Rahul Debnath等的动物实验中证实，用丙酮沉淀从菠萝果中分离出来BR和过氧化物酶，可通过上调抗氧化酶和调节凋亡蛋白的表达，降低体内非霍奇金淋巴瘤的进展，改善诱导淋巴瘤动物的生存率。

Jung‐Ha Lee 等采用MTT法测定用不同剂量的BR处理后的口腔癌细胞Ca9 -22和SCC-25的活力，细胞的存活率明显降低，且呈剂量依赖性。

肿瘤坏死因子（TNF）是体内产生的糖蛋白，能够在体外和体内选择性杀死肿瘤细胞的蛋白质而不损害健康细胞，TNF同时也被证明是一种中枢免疫调节剂。RANSBERGER, KARL的研究发现，BR在体外和体内均可刺激TNF的合成。

密集的细胞外基质(Dense extracellular matrix ECM)是抑制治疗药物在肿瘤组织中渗透的主要障碍。Xin Wang等将BR通过正交酯基交联剂交联，制备了一种新型的pH敏感纳米载流子，BR在交联后仍保持着一定的降解ECM的能力。体内实验表明，pH敏感纳米颗粒在微酸性条件下可以降解，释放的BR通过ECM原位水解进一步促进了纳米颗粒在肿瘤实质中的渗透，与阿霉素产生协同抗肿瘤作用，对肿瘤生长抑制作用达到了62.5%。

化疗药物伊达比星（idarubici）等的原发细胞毒在杀死癌细胞的同时亦杀死正常细胞，而Taşkın Abdullah研究表明，伊达比星与 Br联合使用能够使癌细胞更易受到细胞毒性和遗传毒性的影响，依达比星与BR在低浓度时对HL- 60癌细胞的作用更强，而对PBMC的细胞毒性和遗传毒性较小。Elham Raeisi等的体外试验表明，BR-顺铂联合用药可抑制MCF7细胞的增殖，BR-5-FU联合用药对AGS细胞也有同样的作用。

Valle S J等报告了一种腹膜黏液性肿瘤患者BR和乙酰半胱氨酸( BromAc )的１期临床结果，将引流管插入肿瘤肿块或腹腔，Brom 20 ~ 60 mg，Ac1·5 ~ 2 g于5 %葡萄糖中给药，使肿瘤产生的黏蛋白溶解，可为不能手术的黏液性肿瘤患者提供一种新的微创治疗方法。BR与N-乙酰半胱氨酸结合还可以增强化疗药物如吉西他滨（Gemcitabine）、5-FU、顺铂、多柔比星等化疗药物的疗效并降低毒性，使临床化疗剂量大大减少，用药次数和治疗周期延长，产生更高的疗效。BR还可以与多种药物联用，减少单个药物的用量，使药物组合的总效果大于每种药物的效果之和，从而降低药物的毒副作用，亦即“鸡尾酒”疗法，研究较多的有BR与多种抗癌活性天然药物的组合物。

BR不仅具有化疗增敏作用，还可以用作肿瘤细胞的放射增敏剂，并可保护正常细胞免受辐射作用。Raeisi Farzaneh等研究表明，BR与放射结合可显著降低小鼠乳腺癌细胞（4T1）的生长和增殖，有望用作乳腺癌患者放射治疗的增敏剂。

5、烧伤和清创

BR是蛋白水解酶的混合物，具有分解坏死皮肤能力，对无法手术治疗的创伤病人尤为重要。Samaneh Bayat研究了在动物模型中BR负载壳聚糖纳米纤维修复灼伤的疗效。结果表明，2%BR -壳聚糖纳米纤维具有较好的物理化学性质和释放特性和伤口愈合活性。

Yaron Shoham报导，24名患有不同病因的慢性伤口的患者，连续11小时的酶清创治疗，直到伤口闭合。结果表明，BR清创对慢性伤口安全有效，而由酶清创引起的唯一不良事件是疼痛。TOREN, AMIR研究并公开了一种BR和银离子为主的组合物和应用专利技术，其中含局部麻醉药，以凝胶，乳膏等形式用于深度烧伤的清创术，可减少伤口部位的细菌负荷，保护伤口部位组织免受细菌的污染，克服由于延迟清创所产生的风险，并可避免清创过程的疼痛。ROSENBERG, LIOR 发明的伤口敷料，所含药物包括皮质类固醇、生长因子、杀菌剂、抗生素等，应用后可选择性清除坏死组织，22天的伤口可形成完整的上皮，并能使健康组织基本完好无损。

Mediwound公司生产的Nexobrid，是以BR为基础，用于传统手术切取深度真皮和全厚烧伤的替代治疗的药物。但应用NexoBrid 需要注意的是，对患有糖尿病足烧伤的病人，可能导致进一步坏死的结果。为了更好地指导酶清创术，欧盟发布了酶促清创术( Nexobrid RP )的相关指南。

6、抗病毒

已有BR改善单纯疱疹感染引起的长期多形红斑发作的个案报导，患者用药一年，每天口服BR两次，每次500毫克，可抑制疱疹的再激活，而持续使用抗病毒药物，如阿昔洛韦、瓦拉昔洛韦和福昔洛韦，则不能有效地预防多形红斑的复发。EVANS, ROBIN D 公开了治疗人乳头瘤病毒感染引起的皮肤损伤、扁平疣、丝状疣或足底疣，生殖器疣的组合物，其中含有菠萝蛋白酶。

CoVID-19是冠状病毒SARS-CoV-2引起的严重呼吸综合征疾病，其感染方式是由于SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(spike protein) 可与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)受体蛋白结合，而进入人体细胞，人体细胞中跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS2)，在病毒入侵过程中可激活冠状病毒的刺突蛋白，为SARS-CoV-2进入细胞提供便利，在ACE2受体与TMPRSS2的联合作用下，SARS-CoV-2更容易入侵宿主细胞。CoVID-19并发的炎症和全身凝血引起的多器官功能衰竭是导致死亡的主要原因，而BR具有抗炎和抗凝血特性，使它有可能成为治疗CoVID-19感染症状的候选药物。

近年来，越来越多的研究显示，BR具有潜在的抗SARS-COV-2作用。Sagar S等[43]报导，BR可能通过抑制非洲绿猴肾细胞(VeroE6) 的ACE-2和TMPRSS2的表达，降解SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike Protein)等途径，显著减少 VeroE6细胞中SARS-CoV-2的感染。Akhter Javed et al等报导，SARS-CoV-2的刺突蛋白和包被蛋白（coat protein）含有稳定的二硫键，可与存在于鼻腔黏膜的宿主细胞中的ACE2受体结合，BR和乙酰半胱氨酸( BromAc ) 可通过破坏糖苷键和二硫键协同破坏刺突蛋白和包被蛋白的糖蛋白，而使SARS-CoV-2灭活。Kritis Panagiotis等[45]报导，姜黄素和BR均可抑制SARS-CoV-2进入细胞，而口服BR还可以使姜黄素的吸收明显增加。因此，BR与姜黄素合用对预防COVID-19具有潜在应用价值。

7、其它作用

7.1 肝肾保护  Hawraa M. Murad 等报导，BR对庆大霉素( GNT )致大鼠肝毒性具有保护作用。Ed A等的研究认为，BR因具有抗氧化和螯合作用，对铝致大鼠肾损伤有保护作用，有可能成为治疗金属中毒的一种新方法。

7.2 治疗狼疮  ZIEGLER,RANDY H 的研究公开了一种治疗狼疮的组合物，即每天3次服用含500mg槲皮素，500mg菠萝蛋白酶和500mg维生素C的混合物，可以完全逆转狼疮和其他自身免疫和炎性关节疾病的症状，而单用黄酮类化合物治疗的效果明显低于组合物。

7.3 治疗胃食管反流疾病  EISENSTEIN, MAYER公开了一种以BR及多种消化酶为主的组合物，可以替代质子泵抑制剂、H2受体阻滞剂用于治疗胃食管反流疾病，从而避免这些药物带来的头痛，腹泻，胃部不适，便秘和口干等不良反应。

结语：

综上所述，BR作为一种天然药物，其蛋白水解活性及其增加其它药物的透壁吸收带来的药效，毒副作用低，因而具有非常广泛的开发应用价值。虽然，我国菠萝资源丰富，但对BR药物的应用开发明显不足，作者认为应从以下方面予以改进，同时为BR制剂的开发提供有利条件：

(1) BR制剂品种少，结构不合理。目前上市的药用制剂仅有菠萝蛋白酶肠溶片、复方菠萝蛋白酶肠溶片和芦笋菠萝蛋白酶胶囊三个品种，应利用国外专利到期的机会，或在国外技术研究的基础上，进行新产品开发及技术创新。

(2)制剂的临床应用范围窄，适应症少。应根据不同制剂的特点，拓展新适应症，并开展临床验证工作。

(3)BR原料标准单一，对酶活力（含量）和纯度要求较苛刻。菠萝提取物中含有巯基蛋白水解酶，还含有过氧化物酶、酸性磷酸酶、多种蛋白酶抑制剂和有机结合的钙等复杂成分，BR的来源有果酶和茎酶之分，其酶的组成和特性有一定差异，疗效也就会有差异。因此，可根据品种和适应症的不同，研究和制定不同原料标准，以拓宽BR的应用。

(4)BR制剂的稳定性和有效期不相适应，制约了临床应用和企业对制剂开发的信心，必须对BR及其制剂的稳定性进行深入研究，制定合理的有效期，确保制剂的有效性。

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