蓝光通过SOCS3/STAT3信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

 蓝光通过SOCS3/STAT3信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

李江霞，霍子琪，徐可

复旦大学附属上海市第五人民医院   上海市200240

摘要

目的:检测蓝光照射对骨肉瘤细胞U2OS增殖的影响及机制研究。方法：将骨肉瘤细胞分别放置蓝光和普通培养箱（对照组）中，CCK8法、Edu染色法、平板克隆法检测细胞的增殖，Western blot检测SOCS3和STAT3的蛋白表达。结果：与对照组相比，蓝光照射24h、48h的骨肉瘤细胞A450值降低；蓝光照射10h，Edu染色细胞（即增殖细胞）与总细胞数相比，所占比例下降；平板克隆显示同等数量的细胞在蓝光照射10h后，细胞增殖较少，结晶紫染色较浅。蓝光照射24h，与对照组相比，SOCS3蛋白表达量升高，STAT3蛋白表达量降低。结论：蓝光照射通过SOCS3-STAT3信号通路抑制骨肉瘤U2OS细胞的增殖。

关键词：蓝光；增殖；SOCS3/STAT3

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，儿童和青少年是主要发病人群[1]。目前，骨肉瘤的治疗并不限于手术或药物等单一手段，而是通过新辅助化疗、局部手术治疗以及针对转移部分进行局部治疗多位一体的治疗方式对肿瘤进行控制[2]。因此，探索更多元化的治疗方式有助于延长骨肉瘤患者的寿命，改善患者预后。物理治疗是利用声、光、电、热等物理因素对疾病的治疗方式，该种治疗方式有着创伤小、痛苦轻、患者依从性高等优势。针对骨肉瘤的物理治疗主要集中于辅助化疗或放疗、手术治疗等传统治疗[3]。目前，利用物理因子直接对人骨肉瘤细胞进行作用的研究仍不多。

光作为自然界中一种最常见的物理因子影响许多重要的生物过程[4]。根据不同的波段，光可以分为紫外线（UV）（280-460nm），可见光（400-700nm）、红外线（760-1000nm）。紫外线可以直接被（deoxyribonucleic acid）DNA吸收介导遗传物质的损伤[5]；红外线可以影响细胞内线粒体的功能，对氧化还原反应产生调节作用[6]。近年来，蓝光（400-500nm）作用于哺乳动物体细胞的实验也在逐步展开。目前已知蓝光在临床上应用于新生儿黄疸的治疗[7]、帕金森患者的睡眠障碍治疗[8]等。蓝光对人骨肉瘤细胞的作用也引起广泛的关注，Mingyu He等人发现不同剂量的蓝光可以对人骨肉瘤细增殖、迁移以及侵袭产生影响，同时可以通过增加细胞内（Reactive oxygen species活性氧）ROS生成以及（epidermal growth factor receptor 表皮生长因子受体）EGFR去磷酸化介导人骨肉瘤细胞自噬[9]。ChaoFeng等将三氧化二砷（Arsenictrioxide，ATO）以及蓝光共同作用于人骨肉瘤细胞，这种治疗方法相较其他单一处理组更显著的降低了肿瘤细胞中增殖细胞的百分比，有效对细胞的迁移和侵袭进行了抑制[10]。总之，有关蓝光对骨肿瘤的治疗，还需进一步探索，本研究从细胞水平继续研究蓝光对人骨肉瘤细胞的影响以及调控的机制。

材料与方法

1、细胞培养

U2OS细胞用加入10%胎牛血清（Gibco）的DMEM培养基（Gibco）在37℃，5%CO2的培养箱中培养。待细胞密度达到80%~90%时进行传代，0.25%的胰酶(碧云天)消化后收集状态良好的细胞用于实验。

2、CCK8检测蓝光照射对细胞活力的影响

收集状态良好的U2OS细胞，以3x103/孔的密度分别接种到2个96孔板中，每个96孔板铺9个孔，一个放在37℃，5%CO2的蓝光照射培养箱中，一个放在37℃，5%CO2的普通培养箱中，CCK8（DOJINDO，货号CK04）法检测0h，24h，48h 的450nm处吸光度，每次检测至少3个重复孔。

3、Edu检测蓝光照射对U2OS细胞增殖的影响

取状态良好的细胞悬液，以2x104/孔的细胞密度接种于2个24孔板中，每个板子至少接种3个孔。待细胞贴壁后，将其中一个24孔板放置在37℃，5%CO2的蓝光照射培养箱中，另一个继续放在普通培养箱中培养。10h后取出两个24孔板，以1:1000的比例往培养基中加入EdU A(锐博生物，货号C10310-1)溶液，培养箱中放置30min。然后去掉培养基，用1xPBS清洗一次，4%的多聚甲醛固定30min。1xPBS清洗3次，每次10min。加入0.5%TritonX-100的PBS脱色摇床10min，1xPBS洗5min。每孔加入300ul 1xApollo染色反应液(根据锐博生物C10310-1说明书配制)室温避光摇床孵育30min。加入0.5%TritonX-100的PBS摇床清洗3次，每次10min。每孔加入300ul的甲醇清洗5min，1xPBS清洗5min。用去离子水1:100比例稀释试剂F，制备1× Hoechst33342染色液，室温避光摇床孵育30min

。1xPBS清洗3次，每次10min。荧光显微镜下拍照，每组至少5张10倍镜下的照片，用imageJ软件进行计数，统计蓝光与对照组增值细胞所占比例的差异。

4、平板克隆检测蓝光照射对细胞增殖的影响

将U2OS细胞以2x105/孔的密度接种到2个6孔板中，每个板接种三个孔。待细胞贴壁后将其中一个培养板放到37℃，5%CO2的蓝光培养箱10h，对照组仍在普通培养箱中培养。去掉板中的上清液，1xPBS清洗1次，用4%的多聚甲醛溶液固定30min，1xPBS清洗1次，每孔加入2ml结晶紫染液染色30min，1xPBS清洗3次，拍照。

5、Western blot检测SOCS3和STAT3的蛋白表达量变化

将U2OS细胞接种到6cm细胞培养皿中，每个细胞培养皿接种2x105，共接种4盘。待细胞贴壁，将其中2盘放置37℃，5%CO2的蓝光培养箱24h，对照组仍在普通培养箱中培养。收集细胞，用120ul强RIPA（碧云天）裂解液（1:100加入PMSF）吹打提取蛋白，冰上放置2min，4℃，12000rmp，离心10min，取上清，加入5xloading buffer。100℃恒温干燥仪煮蛋白10min，待放至室温，便可以上样。配置10%的分离胶，上样，90V的恒压电跑蛋白大约1h。转膜，0.22um的PVDF膜在200mA恒流转印2h。1xPBST配置的5%奶粉封闭1h。一抗孵育过夜，1xPBST洗三次，每次10min。1:10000加入二抗（Jackson，货号115-035-003），室温孵育1.5h，1xPBST洗三次，每次10min，曝光拍照。SOCS3一抗来源于Proteintech，货号66797-1-Ig，1xPBST 1:3000稀释使用。STAT3一抗来源于Cell signaling technology，货号9139S，1xPBST 1:1000稀释使用。

结果

1、蓝光照射后细胞形态变化

与对照组相比，蓝光照射24h，48h后U2OS细胞形态学发生了改变，24h大约有30%的细胞失去细胞形态，边缘不清晰。细胞开始向圆形转变，边缘收缩起来。72h大约有70%的细胞呈这种状态（图1）。

图1 蓝光照射不同时间U2OS细胞形态的改变

2、CCK8检测蓝光照射后细胞活性的改变

与对照组相比，蓝光照射24h，OD450值有所下降，表明细胞活力有所下降；蓝光照射48h，OD450值明显下降（图2）。

图2 CCK8 检测蓝光照射不同时间U2OS细胞活力的改变。

3、EdU荧光法检测蓝光照射后细胞增殖能力的变化

EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期替代胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子中。通过EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性。Hoechst33342可以对细胞DNA进行染色。与对照组相比，蓝光照射10h，EdU染色减少，Image J软件分析EdU染色细胞数量占Hoechst33342染色细胞数量（即细胞总数）比例下降（图3）。

图3 EdU实验检测U2OS细胞增殖的变化。如图蓝色表示Hoechst染色，红色代表EdU，柱状图代表统计分析的数据。与对照组比较，P<0.05。

4、平板克隆法检测蓝光照射后细胞增殖的变化

结晶紫染色显示，与对照相比，同等数量的细胞，蓝光照射10h后，结晶紫染色变浅，细胞生长变慢，增殖能力下降（图4）。

图4结晶紫染色检测平板克隆实验U2OS细胞增殖的变化

5、Western blot检测蓝光照射后STAT3和SOCS3表达量的变化

与对照相比，蓝光照射10h后，SOCS3蛋白表达量升高，STAT3蛋白表达量下降（图5）。

图5蓝光照射24h后Socs3和Stat3的蛋白表达量变化。

讨论

肿瘤细胞的增殖情况是判定肿瘤治疗手段是否有效的标准之一。本研究发现，10X镜下可见，经蓝光照射24小时后人骨肉瘤细胞中具有细胞形态的细胞减少，细胞活力下降，细胞增殖活动变缓；蓝光照射48小时后人骨肉瘤细胞大部分呈圆形，边缘光滑，无细胞形态，细胞接近休眠状态。而CCK8实验、Edu增殖实验以及平板克隆实验提示，蓝光照射人骨肉瘤细胞10小时或更长时间后，细胞增殖能力下降，增殖变缓。总之，蓝光照射抑制了骨肉瘤U2OS细胞的增殖。早前就有过光对于生物细胞的生理过程产生影响的报道，光疗已经成为许多医学领域的首选治疗方法，光可以被用来向有选择性的靶向特定结构的组织传递能量，以诱导预期的治疗结果。因此蓝光可能作为治疗骨肉瘤手段之一，然而特定的应用选择光学参数也不简单，波长、能量、暴露时间和通量都可引起广泛的组织效应。MARC CLEMENT等[11]发现过度暴露于蓝光下可能对皮肤细胞造成损伤。因此蓝光作为治疗骨肿瘤方法还有待探索，本研究仅为蓝光直接作用于离体人骨肉瘤细胞，动物实验以及模拟人体内的复杂环境的实验仍需进一步研究。

蓝光如何抑制骨肉瘤细胞增殖也需进一步探索，Ju Ah Yoo等[12]研究发现蓝光抑制人角质形成细胞增殖，上调TRPV1表达，蓝光还抑制了表皮生长因子受体- (EGFR-)介导的信号通路。细胞信号转导抑制因子-3 (SOCS3)是众所周知的Janus激酶-信号转导和转录激活因子-3 (JAK/STAT3)信号通路的反馈抑制剂，可以阻止细胞的恶性转化，促进肿瘤细胞的凋亡，在许多细胞过程中介导细胞因子、生长因子和激素的信号转导[13]。SOCS3的关键作用表现为与JAK激酶和细胞因子受体结合，从而抑制STAT3的磷酸化[13]。蓝光照射后的骨肉瘤细胞SOCS3蛋白表达量升高，STAT3蛋白表达量下降，提示蓝光可能通过调控SOCS3/STAT3通路抑制骨肉瘤细胞的增殖。

参考文献

1.Mirabello, L, R Troisi, and S A Savage, Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: Data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer, 2009.

2.Harris, M E, et al., Treatment of metastatic osteosarcoma at diagnosis: a Pediatric Oncology Group Study. Journal of Clinical Oncology, 1998.

3.Punzalan, M and G Hyden, The Role of Physical Therapy and Occupational Therapy in the Rehabilitation of Pediatric and Adolescent Patients with Osteosarcoma. Cancer treatment and research, 2009.

4.Sutherland, J C, Biological effects of polychromatic light. Photochemistry and Photobiology, 2002.

5.Pfeifer, G P and A Besaratinia, UV wavelength-dependent DNA damage and human non-melanoma and melanoma skin cancer. Photochemical and Photobiological Sciences, 2012.

6.Poyton, R O and K A Ball, Therapeutic photobiomodulation: nitric oxide and a novel function of mitochondrial cytochrome c oxidase. Discovery Medicine, 2011.

7.Mreihil, K, et al., Early Isomerization of Bilirubin in Phototherapy of Neonatal Jaundice. Pediatric Research, 2010.

8.Lin, F, et al., The effects of bright light therapy on depression and sleep disturbances in patients with Parkinson's disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Sleep Medicine, 2021.

9.He, M, et al., Blue LED causes autophagic cell death in human osteosarcoma by increasing ROS generation and dephosphorylating EGFR. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2021.

10.Feng, C, et al., Synergistic anti-tumor effects of arsenic trioxide and blue LED irradiation on human osteosarcoma. International Journal of Biological Sciences, 2019.

11.Clement, M, G Daniel, and M Trelles,

Optimising the design of a broad-band light source for the treatment of skin. J Cosmet Laser Ther, 2005. 7(3-4): p. 177-89.

12.Yoo, J A, E Yu, and S H Park, Blue Light Irradiation Induces Human Keratinocyte Cell Damage via Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) Regulation. 2020. 2020: p. 8871745.

13.Gao, Y, et al., The roles of SOCS3 and STAT3 in bacterial infection and inflammatory diseases. 2018. 88(6): p. e12727.

作者简介：

李江霞，女，硕士，研究实习员，研究方向：骨质疏松和骨肿瘤

霍子琪，男，在读硕士研究生，研究方向：骨质疏松和骨肿瘤

徐可，男，在读博士研究生，研究方向：骨质疏松和骨肿瘤

通讯作者：李江霞，女，硕士，研究实习员，研究方向：骨质疏松和骨肿瘤，Email:1029408716@qq.com。

李江霞，霍子琪，徐可对本文贡献一致

基金项目：闵行区自然科学研究项目（2019MHZ043）