干扰SOX2表达促进紫杉醇诱导肺癌细胞A549凋亡

干扰SOX2表达促进紫杉醇诱导肺癌细胞A549凋亡

孟波

海南省人民医院   海南省  海口市  570100

【摘要】目的 研究紫杉醇对SOX2表达的影响及敲低SOX2表达后紫杉醇对A549的促凋亡作用。方法：①RT-PCR检测mRNA的表达；②MTT法检测细胞的增殖率；③激光共聚焦检测细胞的蛋白定位及蛋白表达变化等；④构建干扰表达siRNA-SOX2载体；⑤western blot检测蛋白表达。结果与结论：①紫杉醇抑制肺癌A549细胞增殖率；②紫杉醇对SOX2干细胞因子表达影响不明显；③干扰SOX2表达后促进紫杉醇诱导A549细胞凋亡。

关键词：肺癌；A549细胞；SOX2；干细胞因子；caspese-3

引言：Introduction

肺癌是如今造成癌症死亡的主要病因，大多数患者被发现时已经处于晚期，无法进行手术治疗，仅能靠药物放疗和化疗维持 1-3。紫杉醇最初被发现能够诱导癌细胞凋亡，近而发现具有治疗多种癌症的作用，在肺癌治疗过程中也有应用4-7。但紫杉醇与癌干细胞因子之间的关系研究较少。C-myc、Oct4高表达与各种癌组织中，作为干细胞因子具有调控细胞恶性转化，有诱导癌干细胞形成促进癌症的进展的作用。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学实验分析。

1.2 时间及地点 2019年1月至2019年5月

1.3.2 实验试剂及仪器

DMEM培养基(Gibco，美国)、胎牛血清(Gibco，美国)、青霉素和链霉素(Sigma，美国)、兔抗人C-myc抗体(Abcam，英国)、兔抗人OCT4抗体(Abcam，英国) 、兔抗人beta-catenin抗体(Abcam，英国)；鼠抗人sox2抗体(Abcam，英国)；Alex647-标记羊抗鼠（羊抗兔） (Abcam，英国)、Alex488-标记山羊抗兔（羊抗鼠）(Abcam，英国)； MTT试剂盒(碧云天，中国)；荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美 国 ) ； 增 强 型 化 学 发 光 显 色 系 统 (Amersham Life Science，美国)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS ，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 构建SOX2干扰表达载体siRNA-SOX2

获取干扰SOX2表达序列后，通过公司合成后经过测序后确定基因序列正确，准备用于实验。

1.4.2 MTT细胞增殖检测

A549细胞以1.5×104个/孔平铺到96孔板中，培养12h后，将紫杉醇 (5μ g/ml、10μ g/ml、15μ g/ml、20 μ g/ml) 选取浓度后分别培养细胞24h、48h后使用MTT法检测细胞增殖抑制率。参考MTT试剂盒说明书，检测上述细胞的增殖。使用酶标仪时吸光度值选择490 nm。每个实验重8孔，以上实验至少重复三次。参考文献。

1.4.3 实时定量PCR(RT-PCR)

将实验细胞培养收集后，使用RNA提取试剂盒（上海生工，中国）按说明书进行实验，提取细胞内的总RNA后，参照RNA RT-PCR引物试剂盒和RT-PCR Starter试剂盒说明书进行实验。

1.4.4 western blot

将实验细胞培养收集后，使用蛋白提取试剂盒（上海生工，中国）按说明书提取蛋白后进行实验。实验用抗体购自Abcam公司，实验方法按照说明进行。

1.4.5胎盘兰染色

将各实验组的细胞收集后，参考说明书经过胎盘兰染色后，使用光学显微镜观察蓝染细胞（死亡细胞被染蓝色）。参考实验方法。

2.1紫杉醇抑制肺癌细胞A549增殖

我们将细胞接种在96孔板中培养12小时后，添加紫杉醇培养细胞(5μ g/ml、10μ g/ml、15μ g/ml、20 μ g/ml) 分别培养细胞24h、48h小时后，通过MTT检测紫杉醇对肺A549细胞的增殖抑制率，发现紫杉醇可以随时间和药物浓度的增加抑肺癌A549细胞的增殖率（图1.）。以上实验提示紫杉醇抑制肺癌A549细胞增殖。

图 1. 紫杉醇对肺癌细胞A549增殖率的影响情况

将A549细胞接种在96孔板中培养12小时后，添加紫杉醇培养细胞(5μ g/ml、10μ g/ml、、15μ g/ml、20 μ g/ml) 分别培养细胞24h、48h小时后，通过MTT检测紫杉醇对肺A549细胞的增殖率的影响。以上实验单独重复三次，**表示p<0.05,具有统计学意义。

2.3 在A549细胞中通过siRNA-SOX2干扰SOX2表达

将A549接种到六孔板中培养至80％融合状态时，将siRNA-SOX2转入A549细胞培养48h后收集细胞，通过RT-PCR检测SOX2的mRNA表达，发现A549

-siRNA-SOX2中SOX2的mRNA表达降低。通过western blot检测SOX2的蛋白表达并进行蛋白灰度值扫描进行统计学分析后，发现A549-siRNA-SOX2中SOX2的蛋白表达降低; 免疫荧光实验检测SOX2蛋白表达,通过激光共聚焦显微镜观察发现A549-siRNA-SOX2中SOX2的蛋白表达降低，细胞核中的SOX2分布减少;以上实验提示在A549-siRNA-SOX2细胞中SOX2被干扰表达。

讨论: Discussion

肺癌发病率逐年上升，手术治疗是肺癌的最佳治疗方式，但往往发病时肺癌已经处在中晚期，手术治疗很难治愈，多添加药物治疗，在很多晚期肺癌患者中药物治疗也是姑且和保守治疗的选择方式。紫杉醇具有抑制肺癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡的作用。紫杉醇的作用机制已经有所阐明，但对于紫杉醇对干细胞因子的表达调控还是研究较少，我们通过我们的实验发现验证了紫杉醇可以促进细胞凋亡，抑制细胞增殖率，可以抑制OCT4、C-myc干细胞因子的表达，提示紫杉醇可以通过抑制干细胞因子的表达发挥抑制癌干细胞的形成和增殖的作用。

参考文献

1.Hoffman P C, Mauer A M, Vokes E E. Lung cancer[J]. Lancet, 2000, 355(9202):479-485.

2.Aniort J, Stella A, Philipponnet C, et al. Muscle wasting in patients with end-stage renal disease or early-stage lung cancer: common mechanisms at work[J]. Journal of cachexia, sarcopenia and muscle, 2019.