新型冠状病毒核酸检测PCR扩增试剂配制后不同条件下保存时间对检测结果影响的探索*

新型冠状病毒核酸检测PCR扩增试剂配制后不同条件下保存时间对检测结果影响的探索*

刘江 ,尤珊 ,张彪 ,秦毅 ,耿见忠

（贵州安康医学检验中心有限公司）

摘要：目的  探索新型冠状病毒核酸检测PCR扩增试剂配制后于不同条件下保存对检测结果的影响。方法  按照新型冠状病毒2019-nCOV核酸检测试剂说明书反应体系的配制方法配制一批PCR扩增试剂并根据使用量进行分装至PCR反应管中，于当日检测一批样本（第1天），剩余试剂分为两组A和B，A组置于4℃冷藏保存，B组置于-20℃冷冻保存备用；以后每天分别对第1天检测的样本使用两组试剂同时检测，记录检测结果，连续检测5天，计算内标（RNP）CT值的CV及每日检测结果与第1次检测结果的差异，评价其稳定性及结果符合率。结果  从第1天至第6天A组试剂检测样本RNP CT值CV-A为3.32%；从第1天至第6天B组试剂检测样本RNP CT值CV-B为2.62%；A组试剂第2天至第5天检测结果与第1天比较，符合率-A分别为：82.61%、75.36%、78.26%、78.26%、73.91%，平均值为77.68；B组试剂第2天至第5天检测结果与第1天比较，符合率-B分别为：78.26%、94.20%、94.20%、81.16%、71.01%，平均值为83.77%。结论  样本分装-70℃超低温保存后使用A、B两组试剂检测，内标CT值CV均小于5%，对检测结果无影响；A、B两组试剂检测样本符合率B组优于A组，但符合率均未达到100%，证实新型冠状病毒核酸检测PCR扩增试剂应根据当批检测样本量进行现配现用，若因提前配制未使用完的试剂，无论置于4℃冷藏保存还是置于-20℃冷冻保存，均有可能对检验结果产生假阴性或假阳性。

关键词： 新型冠状病毒；核酸检测；试剂保存；结果影响。

新型冠状病毒2019-nCOV属于β属冠状病毒，人类普遍易感[1]，在疫情防控期间，各医院检验科及第三方独立医学实验室面临巨大的检测任务，实时荧光RT-PCR方法是检测新型冠状病毒2019-nCOV病原的常规检测方法[1-2]，在进行大批量新型冠状病毒2019-nCOV核酸检测时，PCR扩增试剂配制均按批次配制，由于每日检测样本量较难提前预估，有时可能存在试剂配制数量多于实收样本数量的情况，为评估试剂配制后若不能及时使用，于不同保存条件是否会对样本检测结果造成影响，本研究分别使用A、B两组试剂每日进行样本检测，对样本内标CT平均值、样本检测结果判断与原始结果的一致性进行分析。分别对每天A、B两组试剂检测69例样本结果判定与首次检测结果符合性进行比较，两次结果阴性、阳性判定完全一致的定义为Y；两次检测结果不一致定义为N。

1  材料与方法

1.1  样本  收集2023年1月13日新型冠状病毒核酸检测样本69例，均为单人单管口咽拭子，采样管含胍盐灭活剂[2]。

1.2  主要仪器与试剂  Gentier 96R全自动医用PCR分析系统（西安天隆科技有限公司），KH/AUTO96B全自动核酸提取仪（北京金豪制药股份有限公司），新型冠状病毒（2019-nCOV）核酸检测试剂盒（荧光PCR法）（北京金豪制药股份有限公司），核酸提取试剂（北京金豪制药股份有限公司），新型冠状病毒（2019-nCOV）核酸质控品（北京金豪制药股份有限公司）。

1.3  样本处理  将待检测的69例样本振荡混匀后按提取试剂说明书进行核酸提取，提取完成后将剩余样本于生物安全柜内[1]进行分装，每个样本按0.4mL/每管分装于冻存管中，每个原始样本共分装7份（多余的备用）并按原始样本号做好标识。将分装后的样本按编号排列后置于-70℃超低温保存备用，以后每天对每个样本号取出一支分装管恢复室温后按核酸提取试剂说明书进行核酸提取，连续进行5天。

1.4  扩增检测  按新型冠状病毒2019-nCOV核酸检测试剂盒说明书设置扩增条件，对69例样本进行检测，记录检测结果做为本次研究的参照。以后每天分别使用已配制并分装保存于4℃和-20℃的试剂对分装保存的样本进行检测，每次设置阴性质控3孔及弱阳性质控1孔[1]，根据试剂说明书要求按CT值进行结果判读，无CT值结果判读为阴性，0＜CT值≤38.0结果判读为阳性，38.0＜CT值＜40.0为灰区结果，分别对各次检测结果进行记录。

1.5  结果分析  分别计算A、B两组试剂检测样本内标精密度CV-A、CV-B、符合率-A、符合率-B，CV＜5%、符合率为100%即证实试剂保存方式对样本检测结果无影响。

2  结果 

2.1  样本内标稳定性  

2.1.1   A组试剂检测样本内标稳定性如下表：

表1  A组试剂检测样本RNP 稳定性

2.1.2  B组试剂检测样本内标稳定性如下表：

表2  B组试剂检测样本RNP稳定性

2.2  结果符合率

2.2.1  A组试剂连续5天对样本的检测结果与第1次检测结果比较如下表：

表3  符合率-A统计表

2.2.2  B组试剂连续5天对样本的检测结果与第1次检测结果比较如下表：

表4  符合率-B统计表

2.3结果评价  通过A、B两组试剂对69例样本共5天的检测结果分析，两组试剂检测样本RNP CT值CV均小于5%，符合率-A及符合率-B均小于100%，符合率-B平均值＞符合率-A平均值。PCR扩增试剂配制后需立即使用，如超过24小时，无论是置于4℃冷藏保存还是-20℃冷冻保存，对检测结果均有影响，使结果可能出现假阴性或假阳性。

3  讨论 

由于A、B两组试剂检测69例样本RNP CT值CV均小于5%，说明样本检测后置于-70℃超低温保存不是影响结果变化的因素。

通过A、B两组试剂检测69例结果分析，符合率-B平均值＞符合率-A平均值，提示试剂配制后-20℃冷冻保存优于4℃冷藏保存；为了能保证检测结果的准确性，试剂配制需设置专人专岗，根据标本数量少量多批配制，现配现用。

配制好的试剂如果不能使用完，24小时内是否能置于4℃冷藏保存或-20℃冷冻保存，各种条件能保存多长时间不影响检测结果，需进一步研究。

4  参考文献

[1]国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组.关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案（第九版）的通知联防联控机制综发〔2022〕71号[EB].2022.

[2]国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制医疗救治组.关于印发医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行 第二版）的通知.联防联控机制医疗发〔2020〕313号[EB].2022.

[3]李育敏，龚海娜，付晓歌，等.新型冠状病毒核酸快速检测单靶标阳性结果分析[J].临床检验杂志，2022，40(10):768-770.

[4]阚丽娟，陈大洋，莫红梅，等.新型冠状病毒核酸检测的主要影响因素及控制措施[J].临床检验杂志，2020，38(3):223-225.

[5]耿帜，徐远东，包一熙，等.不同新型冠状病毒核酸检测试剂的临床性能评价[J].临床检验杂志，2021，39(5):337-339.

[6]陈馨宁，黄斐，张春燕，等.分子诊断技术在新型冠状病毒核酸检测中的应用及发展[J].临床检验杂志，2021，39(6):401-406.

[7]张云丽，王鑫，邵玲，等.1种新型冠状病毒核酸检测试剂的性能验证[J].临床检验杂志，2020，38(11):827-830.

[8]陈慧毅，董劲春.浅谈新型冠状病毒核酸检测试剂性能分析[J].标记免疫分析与临床，2021，28(8):1435-1437.

基金项目：中央引导地方科技发展资金项目（黔科中引地[2021]4007）；贵阳市科技计划项目（筑科合同[2022]-4-15号）；贵州安康医学检验中心有限公司科研项目（AK[2022]xx）