SPM促脑发育训练介导脑剪切力通路对缺氧缺血性脑病的作用机制研究

SPM促脑发育训练介导脑剪切力通路对缺氧缺血性脑病的作用机制研究

黄洋洋1 ,苏雪莹1 ,曹思远1 ,刘丽影1 ,苑田田1 ,赵宝山2，赵振河：通讯作者1*

（大庆市科技局指导性科技项目，编号：zdy-2020-20）

（1.哈尔滨医科大学附属第五医院，黑龙江 大庆 163000）

（2.哈尔滨医科大学大庆校区，黑龙江 大庆 163000）

摘要：目的 探究新生儿缺氧缺血性脑病病理机制中脑血管内皮的功能，或许与SPM促脑发育训练增加脑血管剪切力介导的PECAM-1/eNOS/NO通路调控相关联，并最终实现了脑保护作用。方法 选择成年雄性蒙古沙鼠（60-80 克），沙鼠腹腔注射戊巴比妥钠1% (v/w)麻醉，夹闭双侧颈总动脉5分钟诱导缺血，后松解恢复血流。不同组采用SPM促脑发育训练手段，最终分别检测各组的组织形态、蛋白及凋亡检测等相关数据。结果 SPM促脑发育训练可以增加剪切力，继而作用于PECAM-1/eNOS/NO通路影响脑血管内皮功能，内皮功能改善有助于缺氧缺血性脑病的康复。结论 SPM促脑发育训练增加脑剪切力，剪切力通过PECAM-1/eNOS/NO通路改善血管内皮功能，继而改善缺氧缺血性脑病介导的脑损伤。

关键词：缺氧缺血性脑病；PECAM-1/eNOS/NO；剪切力；脑损伤

SPM brain development training mediates the effects of brain shear stress pathway on the mechanism of hypoxic ischemic encephalopathy

Abstract: Objective To explore the function of cerebral vascular endothelium in the pathological mechanism of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy, which may be related to the regulation of PECAM-1/eNOS/NO pathway mediated by SPM promoting brain development training and increasing cerebral vascular shear force, and ultimately achieve brain protection. Methods Adult male Mongolian gerbils (60-80g) were selected and anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital sodium 1% (v/w). Bilateral common carotid arteries were occluded for 5 minutes to induce ischemia, and then released to restore blood flow. Different groups were trained with SPM to promote brain development, and finally relevant data such as tissue morphology, protein, and apoptosis detection were detected in each group. Results SPM brain development training can increase shear stress, which in turn acts on the PECAM-1/eNOS/NO pathway and affects the endothelial function of cerebral blood vessels. The improvement of endothelial function is conducive to the rehabilitation of hypoxic ischemic encephalopathy. Conclusion SPM brain development training increases brain shear force, which improves vascular endothelial function through PECAM-1/eNOS/NO pathway, thereby improving brain injury mediated by hypoxic ischemic encephalopathy.

Keywords:

Hypoxic ischemic encephalopathy; PECAM-1/eNOS/NO； Shear force; brain damage

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是新生儿科常见多发疾病[1]，当前较为公认的HIE病理学说包括：神经元细胞钠-钾ATP泵障碍导致的细胞毒性水肿[2]；钙离子通道异常所致的钙离子超载[3]；氧化应激过激反应介导的损伤[4]；兴奋性氨基酸的持续性释放[5]；在HIE的病理过程中上述机制最终导致了神经元细胞的凋亡和坏死[6]，继而诱发不同程度的临床症状和体征，严重的HIE可致患儿死亡，幸存者仍遗留严重的永久性神经系统损害[7]，如智力低下、运动障碍、脑瘫及癫痫等。大量的研究证明神经血管单元（neurovascular unit NUV）的结构及功能完整对维持脑的正常功能具有更重要的作用[8]。NVU是由多种细胞组成的神经系统的结构和功能单位，其中脑微血管内皮细胞是NVU结构的主要细胞，微血管内皮细胞是目前评价血管功能特异且较直接的指标[9]。血流剪切力(τ)是血液顺着流动方向作用于血管壁单位面积上的侧压力，可通过对内皮细胞的形态、分化与成熟、生物活性物质及细胞因子的分泌和血管的通透性[10]等方面的调节，参与调控血管结构和功能的重建。血流剪切力对血管内皮细胞的活性影响极为重要。而PECAM-1因其在发育和成熟个体的所有血管内皮细胞都高度表达，常被作为血管内皮细胞的标志物。本实验旨在探讨：1.剪切力影响缺氧缺血性脑病诱导的脑微血管内皮细胞及神经元损伤；2.运用SPM促脑发育训练手段增加剪切力可通过PECAM-1/eNOS/NO途径调节脑微毛细血管的活性，减少缺氧缺血性脑病所致的微毛细血管内皮细胞损伤，从而实现脑保护作用。

1.对象和方法

1.1 SPM促脑发育训练（Swimming-Position-Microcirculation）是由哈尔滨医科大学附属第五医院儿科专家团队联合哈尔滨医科大学大庆校区基础实验室共同创建的一种全脑促脑发育训练手段，简称SPM促脑发育训练，尤其适用于0-6个月脑损伤婴儿，具体内容包括集抚触、游泳、倾斜板、杜曼闪卡综合一体的脑康复治疗手段。其核心理念是增加脑血管剪切力，从而促进脑保护作用。平行对照至该实验中，在动物中主要采取倒立训练手段。

1.2缺氧缺血性脑病动物模型建立参照文献：由哈尔滨医科大学（大庆）动物实验室提供，选择成年雄性蒙古沙鼠（60-80g），沙鼠腹腔注射戊巴比妥钠1% (v/w)麻醉，麻醉后夹闭双侧颈总动脉5分钟诱导缺血，诱导缺血后松解以恢复血流，造成缺氧缺血性脑病的动物模型，对模型组和正常组进行倒立5分钟训练。

1.3沙鼠海马组织取材：首先将沙鼠脱颈椎处死后，剪开小鼠的头皮，暴露出头部，然后用直镊将鼠脑壳拨开，海马组织位于大脑皮层（cerebral cortex）底部，用直镊小心地将大脑皮层拨开，暴露出海马组织，双侧同理，暴露出双侧海马组织，然后将海马组织与大脑皮层及周围的脑组织分开，最后小心地将海马组织取出，并置于生理盐水中侵泡待处理。

1.4免疫组化：对PECAM-1、NeuN和eNOS的表达进行成像，组织切片依次用0.3%氢气处理过氧化物10分钟，用PBS漂洗5分钟并洗涤三次。切片与抗PECAM-1（1:100，Abcam，Cambridge，MA，美国），抗NeuN（1:200，Chemicon，CA，美国）和抗eNOS(1:300, Abcam, Cambridge, MA, United States) 抗体在4℃去除一抗溶液后，用PBS洗涤3次，将组织与二抗一起孵育1小时，用PBS洗涤3次，用DAPI对组织进行复染(Beyotime Biotechnology, Shanghai, China)。用于定性分析的图片在200倍时获得的和400倍放大。

1.5统计学分析

采用SPSS21.0软件，数据分析采用 x±s的形式描述，组间对比采用t检验，多组间对比采用方差分析，P <0.05被认为差异显著有统计学意义。

2. 结 果

2.1各组鼠海马神经元形态

试验分四组即正常组（Sham）、模型组（I/R）、正常+倒立组（Sham+900）、模型+倒立组（I/R+900），通过分析得出，I/R较Sham显著损伤（P <0.05）；I/R+900较I/R损伤有所减轻（P <0.05），但较Sham仍有差距（P <0.05）。如图：

2.2各组Caspase-3、PECAM-1、eNOS的表达

试验分四组即正常组（Sham）、模型组（Model）、正常+倒立组（Sham+SS）、模型+倒立组（Model+SS），通过分析得出，Caspase-3层面Model较Sham显著上调（P <0.05），Model+SS较Model明显下调（P <0.05

）；PECAM-1层面Model较Sham显著下调（P <0.05），Model+SS较Model明显上调（P <0.05）；eNOS层面Model较Sham显著下调（P <0.05），Model+SS较Model明显上调（P <0.05）。如图：

3. 讨 论

众所周知，中重度的缺氧缺血性脑病可致患儿不同程度的脑损伤[11]，虽然当前HIE的致病机理未完全阐明，但其各种机制抑或通路最终介导的迟发性神经元凋亡及坏死[12]，并最终导致智力、运动等功能受损当前已被充分证实。

通过实验我们不难发现，缺氧缺血性脑病的确会导致实质性的脑损伤，当前临床普遍认为，严重的缺氧缺血性脑病可致患者不同程度的脑功能障碍[13]。海马区作为中枢神经系统的重要组成部分[14]，司职学习、记忆等重要功能[15]。通过免疫组化对鼠大脑海马组织进行分析，也不难看出缺氧的确加重了对海马神经元的损伤，当给予倒立手段这种损伤有所减轻，由此我们可以推论，增加剪切力在缺氧所致的脑损伤保护机制层面是有效的。与此同时，通过免疫组化进一步分析，当增加剪切力时，血管内皮PECAM-1、eNOS是上调的，这更加证实了我们初始的推测，即增加剪切力可通过PECAM-1/eNOS/NO途径调节脑微毛细血管的活性，减少缺氧缺血性脑病所致的微毛细血管内皮细胞损伤，从而实现脑保护作用。但客观的讲，本实验仅从剪切力及内皮相关单一通路的角度论证其在缺氧缺血性脑病中的脑保护机制，仍需进一步探究论证，并进一步开展分子生物及细胞实验等更深层次的探索。从另外一个角度分析，或许剪切力及其介导的PECAM-1/eNOS/NO通路不是参与调控缺氧缺血性脑病致病机理中的最优或最有力机制，但起码我们的研究为今后的探索及病理机制学说完善提供了一定的思路，而这种探索对今后临床开展新生儿缺氧缺血性脑病的疾病诊疗及预后也提供了一定的理论支持。

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该项目系2020年度大庆市科技局指导性科技项目，编号：zdy-2020-20。

第一作者：黄洋洋，男，预备党员，哈尔滨医科大学附属第五医院儿科一病区主治医

师，哈尔滨医科大学儿科学硕士研究生，研究方向：小儿呼吸、神经内科。

通讯作者：赵振河，男，中共党员，哈尔滨医科大学附属第五医院儿科主任，哈尔滨

医科大学儿科学硕士研究生，儿科主任医师。研究方向：小儿呼吸、神经、消化等内科。