磷酸奥司他韦胶囊微生物限度检查法适用性验证

磷酸奥司他韦胶囊微生物限度检查法适用性验证

黄琼姑

海南亚洲制药股份有限公司, 海南 海口 570311

1目的

通过磷酸奥司他韦胶囊的微生物限度检查法适用性验证，确保测定方法的可靠性，确保检验结果的准确可靠。

2范围

本验证适用于磷酸奥司他韦胶囊微生物限度检查的方法适用性检查。’

3概述

磷酸奥司他韦胶囊中的奥司他韦可能具有抑菌性，为了避免奥司他韦对微生物产生抑制作用，因此选择薄膜过滤法对磷酸奥司他韦胶囊的微生物进行检测。

4验证依据

4.1《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法；

4.2《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法；

4.3《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则1107非无菌药品微生物限度标准；

5验证方法

5.1试验菌株选择

5.2菌种信息

5.3新鲜培养物制备

5.3.1金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌的菌株冷冻管各1管，用接种环蕉取1环接种至胰酪大豆胨琼脂培养基斜面上，30℃~35℃培养18-24h。

5.3.2白色念珠菌菌株冷冻管各1管，用接种环蕉取1环接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃~25℃培养时间2~3天。

5.3.3黑曲霉菌株冷冻管各1管，用接种环蕉取1环接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面上，20℃~25℃培养时间5~7天。

5.4稀释级别选择

5.4.1菌液制备

5.4.1.1取以上铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和大肠埃希菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，按照下表取新鲜培养物各1ml，分别加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，稀释成1号菌悬液，再从1号菌悬液需1ml，分别加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml ，配成2号菌悬液，以此类推，共配成N号菌悬液。

5.4.1.2黑曲霉菌悬液

取以上黑曲霉的新鲜培养物加入约45℃的含5%(ml/ml)聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用移液管取孢子悬液1ml至无菌试管内，用含5%(ml/ml)聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，稀释成1号菌悬液，再从1号菌悬液需1ml，加5%(ml/ml)聚山梨脂80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，配成2号菌悬液，以此类推，共配成N号菌悬液。

5.4.2菌悬液浓度的选择

5.4.2.1需氧菌和控制菌的菌悬液中菌悬液浓度的确认：取上述1至N号菌悬液（铜绿假单胞菌悬液、金黄色葡萄球菌悬液枯草芽孢杆菌悬液、白色念珠菌悬液、黑曲霉菌悬液）、大肠埃希菌各1ml 分别注入平皿中，立即倾注15ml～20ml约45℃的胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA)，每株试验菌平行制备2个平皿，按照相应条件进行培养。计算各试验菌的平均菌落数，找出含菌数50～100cfu 的菌悬液进行试验。

5.4.2.2霉菌和酵母菌的菌悬液中菌悬液浓度的确认：取上述1至N号菌悬液（白色念珠菌悬液、黑曲霉菌悬液），分别注入平皿中，立即倾注15ml～20ml约45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按照相应条件进行培养。计算各试验菌的平均菌落数，找出含菌数50～100cfu 的菌悬液进行试验。

5.5需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验

5.5.1供试液制备

供试液制备按照以下表格的要求进行配制，缓冲液采用温度约45℃的含5%聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，配制过程要求供试品或者缓冲液充分混合：

5.5.2接种：

5.5.2.1试验组

5.5.2.1.1需氧菌

量取供试品溶液（1：100）1ml，分别置无菌试管中，接种试验菌悬液1ml（每1ml菌悬液含菌数不超过100cfu），加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上培养，平行制备两份。

5.5.2.1.2霉菌与酵母菌

量取供试品溶液（1：20）1ml，分别置无菌试管中，接种试验菌悬液1ml（每1ml菌悬液含菌数不超过100cfu），加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养，平行制备两份。

5.5.2.2菌液对照品组

5.5.2.2.1需氧菌

量取约45℃的5%聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌试管中，接种试验菌悬液1ml（每1ml菌悬液含菌数不超过100cfu），加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上培养，平行制备两份。

5.5.2.2.2霉菌与酵母菌

量取约45℃的5%聚山梨酯80的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌试管中，接种试验菌悬液1ml（每1ml菌悬液含菌数不超过100cfu），加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养，平行制备两份。

5.5.2.3供试品对照组

5.5.2.3.1需氧菌

量取1:100稀释级别的供试液1ml，置无菌试管中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至胰酪大豆胨琼脂培养基上培养，平行制备两份。

5.5.2.3.2霉菌与酵母菌

量取1:20稀释级别的供试液1ml，置无菌试管中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基培养，平行制备两份。

5.5.2.4阴性对照组：量取相应稀释液代替供试液和菌悬液同试验组操作，阴性对照试验应无菌生长，需要配制两份阴性对照组。

5.5.3培养

5.5.3.1需氧菌数培养：总需氧菌数测定选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和黑曲霉，培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌，于30～35℃培养不超过3天；白色念珠菌、黑曲霉，于30～35℃培养不超过5天。

5.5.3.2霉菌和酵母菌培养：总霉菌和酵母菌测定用白色念珠菌和黑曲霉，培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基，于20～25℃培养不超过5天。

5.5.4试验菌回收因子计算公式：

5.5.5结果判断：

5.5.5.1计数方法适用性试验中，采用薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。

5.5.5.2方法适用性验证时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行该产品的检查。

5.6控制菌检查方法适应性试验-大肠埃希菌

5.6.1试验菌悬液制备

详见5.4.1，菌液应在2小时内使用。

5.6.2供试液制备：

详见需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验供试液制备项下5.5.1。

5.6.3预培养：

5.6.3.1试验组：

吸取取供试品溶液（1：20）20ml，加至过滤装置中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜置盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的无菌锥形瓶中，加入1ml含菌数50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，混匀，30～35℃培养18～24h。

5.6.3.2阳性对照组：

取45℃的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液20ml代替供试液，加至过滤装置中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜置盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的无菌锥形瓶中，加入1ml含菌数50～100cfu的大肠埃希菌菌悬液，混匀，于30～35℃培养18～24h。

5.6.3.3供试品对照组：取1:20供试液20ml，加至过滤装置中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜置盛有100ml胰酪大豆胨液体培养基的无菌锥形瓶中，混匀，于30～35℃培养18～24h。

5.6.3.4阴性对照：取45℃的5%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液20ml，加至过滤装置中，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，滤过，反复操作3次，取滤膜置盛有90ml胰酪大豆胨液体培养基的无菌锥形瓶中，混匀，于30～35℃培养18～24h。

5.6.4选择培养

振摇上述试验组、阳性对照组、供试品对照组和阴性对照的预培养物容器，各量取1ml预培养物，接种至99ml的麦康凯液体培养基中，混匀，于42～44℃培养箱中培养24～48h。

5.6.5继续培养：

取选择培养物，划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃培养箱中培养18～72h。

5.6.6结果判定：

若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品检查；若未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法适用性试验。