抗金黄色葡萄球菌的南极微生物的筛选鉴定[1]

抗金黄色葡萄球菌的南极微生物的筛选鉴定[1]

赵敬哲1，郑立2，徐麓凯1，李梦宇1，朱玺铮1，金黎明1*

大连民族大学 生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600；

2. 自然资源部第一海洋研究所 自然资源部海洋生态环境科学与技术重点实验室，山东 青岛 266061

摘  要：采用稀释涂布平板法从南极团结湖沉积物中分离纯化海洋微生物，用对峙培养法对金黄色葡萄球菌拮抗菌株进行初筛，采用琼脂扩散法进行复筛，并通过形态观察、生理生化试验和分子生物学技术进行菌种鉴定。结果表明，从南极团结湖沉积物样品中共分离纯化出64株微生物，经过初筛，得到6株有抑制效果的拮抗菌，复筛后出1株对金黄色葡萄球菌有最好抑制效果的菌株，抑菌圈直径达（35.20±0.20）mm，编号为TJ59，经鉴定为弗氏甲基杆菌（Methylobacterium frigidaeris）。

关键词：南极团结湖；金黄色葡萄球菌；分离；筛选

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人类化脓感染中最常见的病原菌，轻者皮肤感染，严重者可致心内膜炎，或是其他威胁生命的疾病。近年来由于抗生素的广泛使用，90%以上的金葡菌已经产生了耐药性，为了及时控制感染，优化选择抗菌药物、发现新型抗菌药物显得尤为重要。近年来南极地区微生物学的研究逐步引起了人们的注意，南极微生物生理特点和代谢机制会产生不同于陆地微生物的变化，因此更容易产生新的抗菌活性物质。

本研究以南极团结湖沉积物样品为研究对象，分离、纯化、筛选能够抑制金黄色葡萄球菌生长的菌株，对其进行菌种鉴定，为后期从菌种得到活性抗菌物做好前期基础，并进一步对其抗菌活性物质进行研究，其应用前景广阔丰富。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品为南极团结湖沉积物样品，自然资源部第一海洋研究所提供。所有菌株为本实验室保藏。培养基按照文献方法配制[1-2]。

1.2 仪器与设备

日本HIRAYAMA公司HVE-50高压灭菌器；日本Airtech公司SW-CJ-2FD超净工作台； 德国IKA公司RV10旋转蒸发仪。

1.3 实验方法

1.3.1 南极微生物的分离、纯化

菌株的分离采用稀释涂布平板法[1-2]。

1.3.2 拮抗菌株的筛选

初筛：吸取5 μL待测样菌液点在LB平板上，分别放到适宜待测菌种生长温度下培养24 h，再将混有金黄色葡萄球菌悬液的LB培养基作为上层平板覆盖其上，37 ℃培养12 h，观察有无抑菌圈出现。

复筛：采用琼脂扩散法[1-2]。

1.3.3 金黄色葡萄球菌拮抗菌株的鉴定

（1）形态观察及生理生化实验

将筛选得到的金黄色葡萄球菌拮抗菌株观察其形态特点，进行生理生化实验，再根据《伯杰细菌鉴定手册》[3]进行鉴定。

（2）分子生物学鉴定

PCR法对筛选得到的金黄色葡萄球菌拮抗菌株的16S rDNA基因序列进行扩增[1-2]并测序。得到的测序结果提交NCBI的GenBank数据库中，进行同源性搜索比对。选取同源性较高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA 6.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法绘制系统发育树[1-2]。

2 结果与分析

2.1 南极微生物的分离纯化和筛选

从南极团结湖沉积物样品中共分离得到64株菌株。初筛选出6株对金黄色葡萄球菌有明显抑制性的菌株。复筛得到1株效果最好的菌株TJ59。

2.2 菌株TJ59的鉴定

2.2.1 形态观察

菌落及细胞形态见图1。TJ59菌落直径0.3-0.4 mm，菌落颜色为乳白色半透明状，菌落质地为乳状、光滑粘稠，菌落中央突起呈圆形，边缘相对整齐，有臭味。镜检观察为革兰氏阳性菌。

a                                 b                               

a为菌落形态；b为革兰氏染色结果。

图1 TJ59菌株的形态学特征

2.2.2 生理生化鉴定结果

生理生化试验结果如表1所示。TJ59菌株能分解葡萄糖产酸且不产气，能使明胶液化、淀粉水解，能产生过氧化氢酶，油脂水解试验、吲哚试验、尿素试验均呈阴性。

表2 菌株TJ59的生理生化特征

注：“+”表示结果呈阳性；“-”表示结果呈阴性。

2.2.3 16S rDNA序列分析及系统发育树的构建

TJ59的系统发育树见图2。可知TJ59菌株与标准菌株Methylobacterium frigidaeris于一支，亲缘关系最近，最终鉴定菌株TJ59为弗氏甲基杆菌（Methylobacterium frigidaeris）。

图2 基于16S rDNA序列TJ59菌株的系统发育树

3 结论

本研究以金黄色葡萄球菌为指示菌，从南极团结湖沉积物中共分离出64株南极微生物，其中对金黄色葡萄球菌有抑制作用的菌株有6株，效果最好的为菌株TJ59，抑菌圈直径为（35.20±0.20）mm。通过鉴定，判断其为弗氏甲基杆菌（

Methylobacterium frigidaeris）。下一步将对其代谢产物进行研究，以期发现结构新颖的活性物质。

参考文献：

[1] 宋红丽,杨佳夷,郑立,等. 抗铜绿假单胞菌南极微生物的筛选、鉴定及其抑菌谱研究[J]. 中国酿造,2022,41(11):108-112

[2] 徐麓凯,刘一平,韩袁彤,等.抗副溶血弧菌海洋微生物的筛选、鉴定及抑菌谱研究[J].中国酿造,2022,41(11):61-65

[3] BIJCHANAN R E, GIBBONS N E. 伯杰细菌鉴定手册[M]. 第8版. 北京科学出版社, 1984: 729-736.