细胞微胶囊制备方法的研究进展

细胞微胶囊制备方法的研究进展

林鹏

绍兴莱洁新材料科技有限公司,浙江省绍兴市312000

摘要：细胞微胶囊技术采用微囊包裹具有特定功能的组织细胞，形成免疫隔离的人工细胞，已显示出越来越广阔的应用前景。本文简述了细胞微胶囊的结构及作用，并绍了细胞微胶囊的制备方法与研究进展，最后提出细胞微胶囊的研发方向及技术展望。

关键词：细胞微胶囊；微囊化技术；生物相容；人工细胞；免疫隔离

1简介

　　人工器官有望在21世纪造福于人类，其中人工细胞具有简便易行的优点，但同样存在免疫排斥反应和同种移植物来源稀少两大难题，限制其应用。而解决免疫排斥难题的有效途径之一，是以微胶囊作为免疫隔离装置，利用微胶囊包裹具有特定功能的组织或细胞，通过微胶囊的选择渗透性膜对组织或细胞，进行免疫保护，可以在无需免疫抑制剂的条件下进行同种异体或异种移植，补充疾病体内缺乏的生理活性物质，从而达到治疗疾病的目的。微胶囊的免疫隔离原理如图1示意。

用于细胞培养、移植的微胶囊，称之为细胞微胶囊，它是将微生物、动植物细胞包封在一层亲水性的半透膜内所形成的珠状微胶囊，使细胞阻隔在微胶囊的膜内或膜外，而氧气、外环境营养物以及囊内细胞代谢物等小分子物质则可以自由通过微胶囊膜进行物质传递，从而达到培养、催化、免疫隔离、基因运载等目的。

图1 细胞微胶囊免疫隔离原理

2制备方法

普通微胶囊采用的制备方法，常涉及反应环境的变化，并使用到有机溶剂，不适于细胞等生物活性物质的微囊化。在细胞囊心物和囊材的混合物中，加入另一种物质或采用其他适当的方法使囊材的溶解度降低而凝聚在囊心物质的周围，形成一个新相。使囊材凝聚的方法包括聚电解质盐析、多聚电解质络合、温度改变等物理化学手段，这种方法为液中固化覆膜法，是细胞微胶囊制备的最常用方法。

2.1聚电解质盐析法

聚电解质与某些盐的作用下生成凝胶沉淀析出，利用此特点可以制备微胶囊。

经典的海藻酸钠细胞微胶囊制备就是采用海藻酸钠遇二价离子产生凝胶化[1]，海藻酸钠的微囊化技术已经出现在肝细胞、生长激素替代物、肾上腺和甲状腺组织移植领域，表现出良好的免疫隔离性能。但微胶囊系统的生物相容性仍不理想，这与制备过程和海藻酸钠的纯度和类型有关。

壳聚糖源于甲壳素，与三聚磷酸钠溶液能形成微胶囊。当壳聚糖盐酸溶液滴入凝结液接触瞬间，界面上部分壳聚糖分子沉淀形成固化膜，凝结液中的阴离子可以中和壳聚糖氨基上的电荷，促进壳聚糖絮凝，从而加速了固化膜的形成。江龙法等[2]对红酵母细胞进行包埋，表明该法进行固定化细胞的可行性，并且确认固化速度随脱乙酰度提高而加快，分子量影响着微胶囊的机械性能和稳定性。

2.2多聚电解质络合法

带相反电荷聚合物的反应是在活细胞周围形成物理性膜屏障的最简单方法。由于采用水溶性荷电聚合物，因此更利于制备和发展水包囊系统，通过这种原理制备微胶囊的显著优点是制备过程温和，微囊化的生物活性物质在制备过程中活性损失很少或不损失。这种方法制备工艺为：将荷电聚合物溶液的细胞悬浮液挤压成液滴，并滴入带相反电荷聚合物的水溶液中完成微囊化过程。

海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠（APA）胶囊是最为成熟，1980年由Lim和Sun发明，并首先利用APA微囊化技术在老鼠上进行异种胰岛移植 [3]。这种胶囊由两层海藻酸夹一层聚赖氨酸的“三明治”结构膜，具有高度生物相容性，可截留分子量大于11×104的物质，从而可以阻隔分子量在16×104左右的抗体及免疫活性细胞，起到免疫保护作用。实验研究已证明：APA微囊具有较好的生物相容性，可在动物体内保护异种胰岛在宿主动物体内存活并维持功能达26个月之久，无明显的毒副作用。

NaCS-PDADMAC生物微胶囊是由硫酸纤维素钠（NaCS）和聚二丙烯基二甲基氯化铵（PDADMAC）等两种水溶性聚合物电解质构成的全新的生物微胶囊。该微胶囊体系在80年代初由德国Dautzenberg博士首次开发出来。将含有生物细胞悬浮液的NaCS水溶液滴入含有PDADMAC的水溶液中时，NaCS将立即与PDADMAC发生快速反应，形成厚约20～100ｍ半透膜的细胞微胶囊。与APA微胶囊相比，该微胶囊具有制备方法简单，膜物理化学性质稳定及机械性能好等优点[4]。

2.3温度改变法

基于一些聚合物具有温敏溶解特性，提高或降低温度，使含有细胞悬浮液的聚合物转变为凝胶。琼脂糖是一种热致性聚合物，42℃以上熔化为液态，冷却后成为凝胶，故温度改变技术在琼脂微胶囊中应用较多。Tun开发了一种多层修饰的琼脂糖微胶囊[5]，是由琼脂糖与聚苯乙烯磺酸（PSSa）的混合基质组成囊核，其外包覆由聚凝胺与羧甲基纤维素组成的囊膜，这样可以显著延长寿命及微囊内细胞的活性。Jain开发制备了一种球形琼脂复合大胶囊[6]，由凝胶泡沫-琼脂糖、胶原质-琼脂或仅由琼脂糖形成，主要解决胶囊的回收性问题。

2.4抽提溶剂法

Sefton等发展了一种抽提溶剂的界面沉淀工艺

[7]，可用于在非水溶性热塑性聚合物包封哺乳动物细胞。形成液核，再用聚合物包围液滴以形成液壳，抽提聚合物溶剂使液壳固化。核-壳液滴可通过同轴挤压装置生成，采用空气流剪切液滴，在液-空气界面采用一种震荡挤压装置以改善液滴的均一性以及减少气流剪切对细胞的破坏。这种方法的缺陷是制备过程残留的有机溶剂造成细胞毒性问题。早期采用的是相对无毒的PEG-200，并设计减小细胞活性损失工艺过程。

2. 5共形包衣

共形包衣是细胞微囊化的一个特例，这是小的细胞群或小组织块上直接形成屏障的方法。这种方法通过囊膜包围细胞群而消除了微胶囊的死腔，因而有效改善了胶囊表面和细胞群之间的质量传递，并提高了细胞的包封效率。共形包衣不适于单细胞，但对于较大尺寸的细胞簇来说却是理想的，最初用于胰腺胰岛。May和Sefton[8]使胰腺胰岛在离心过程中通过聚丙烯酸酯的PEG-200溶液，随后再通过水相，使聚合物在胰岛周围沉淀。

2.6原位聚合法与界面聚合法

原位聚合法与界面聚合法均为化学手段制备细胞微胶囊，聚合技术生成的是一种通过共价键网络支持的膜，不同于聚电解质和相转化膜。原位聚合法早期工作集中于采用丙烯酰胺作为聚合单体。需要考虑引发剂、单体、自由基种类的毒性，微囊制备过程中要限制反应分子扩散进入细胞。包封活细胞的原位聚合技术由Dupuy[9]等开发。

Sawhney[11]报道了一种在胰腺胰岛周围共形聚合形成聚乙烯醇膜的界面聚合工艺。这种工艺在水相中进行，通过吸附在细胞表面的光引发剂在胰岛表面引发聚合，所形成的为均相膜。该法对光引发剂的选择极其重要，它不仅应具有一定的细胞膜相关的疏水性，还不会过度吸附以干扰细胞膜的自身结构。

3结语

微胶囊包埋组织细胞已经向人类展示了美好的应用前景，相信随着化学、化工、材料、生物和医学等领域的不断结合与发展，微胶囊技术研究必将取得重大进展。目前仍需在以下基础工作做进一步的细致研究：（1）适应不同应用环境的材料及加工技术；（2）条件温和易于规模化生产的制备技术；（3）微胶囊制备条件-膜结构-性能关系；（4）微胶囊应用环境中的动态行为变化规律、膜内外物质传递规律以及生物相容性的化学本质；（5）微胶囊的临床应用及理论基础。在基础研究的不断推动下，细胞微胶囊技术在异种和异体移植、工业化大规模培养、细胞因子替代治疗及缓释控释生物活性药物筛选等领域的应用研究可进入快速发展时期[11]。

参考文献

1 袁晓露,李宝霞,黄雅燕等.海藻酸钠微囊的制备及应用进展.化工进展,2022,41(6):3103-3110.

2江龙法,张所,薛婉丽等. 壳聚糖生物微胶囊的制备及应用研究. 淮海工学院学报, 2001,10(2):50-52.

3 Lim F, Sun A M. Microencapsulated islets as bio-artificial endocrine pancreas. Science, 1980, 210:908-909.

4张俊，姚善泾，大孔型NaCS-PDADMAC生物微胶囊的制备，化学反应工程与工艺，2005，21(1):65-69.

5 Tun T, Inoue K, Hayashi H, et al. A newly developed three-layer agarose microcapsule for a promising biohybrid artificial pancreas: rat to mouse xenotransplantation. Cell Transplant, 1996,5:S59-S63.

6 Jain K,Yang H, Cai B-R,et al. Retrievable, replaceable, microencapsulated pancreatic islet xenografts. Transplantation, 1995,59:319-324.

7 Sefton M V, Dawson R M, Brougton R L, et al. Microencapsulation of mammalian cells in a water-insoluble polyacrylate by coextrusion and interfacial precipitation. Biotechnol Bioeng, 1987,29:1135~1143.

8 May M H, Sefton M V. Conformal coating of small particles and cell aggregates at a liquid-liquid interface. Ann NY Acad Sci, 1999,875:126~134.

9 Dupuy B, Cadic C, Gin H, et al. Microencapsulation of isolated pituitary cells by polyacrylamide microlatex coagulation on agarose beads.

Biomaterials, 1991, 12:493~496.

10 Campioni E G, Nobrega J N, Sefton M V. HEMA/MMA microcapsule implants in hemiparkinsonian rat brain: biocompatibility assessment using [3H] PK11195 as a market for gliosis. Biomaterials, 1998, 19:829~837.

11董化江,李刚，王绍辉等.细胞微囊化技术的研究进展.国际生物医学工程杂志,2017,40(4):291-301.