Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药中的表达及意义

Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药中的表达及意义

罗亮  周娟  丁婷

(井冈山大学附属医院血液肿瘤科，江西 吉安 343000)

摘要：目的 探讨Beclin1、LC3 及 P53 在肺腺癌 EGFR-TKI 耐药的表达意义。方法 选取我院80例晚期肺腺癌患者标本，采用SP和RT-qPCR检测靶向治疗前与靶向耐药后自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p53的表达水平。结果 与靶向治疗前比较，在靶向治疗耐药后，Beclinl、LC3 和p53在肺癌组织中的相对表达量比较差异均具有统计学意义(P<0.05）。结论 自噬相关蛋白Beclin1、LC3 及 P53表达水平与EGFR-TKI耐药呈现相关性。

基金项目：吉安市指导性科技计划项目

作者简介：罗亮，男，（1986.6--），硕士，主要从事肿瘤临床工作

肺癌是常见的呼吸系统肿瘤，其发病和死亡率逐年上升[1]。表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR-TKI)通过抑制酪氨酸激酶的活性，阻断肿瘤细胞增殖和生长的通路，从而抑制肿瘤细胞的生长、迁移和加快其凋亡。EGFR-TKI的应用不仅改善了患者预后，还延缓了肿瘤进展，对肺癌的治疗具有重要意义，但EGFR-TKI耐药问题亦不容忽视。

近年来，自噬和肿瘤的关系逐渐引起重视，自噬相关基因在肿瘤的发生、生长及转移的过程中发挥重要的作用[2]，通过调控自噬的表达可能逆转肿瘤细胞对EGFR-TKI的耐药。本研究通过检测自噬相关蛋白在肺腺癌靶向治疗中的表达水平，探究肺癌自噬相关蛋白与EGFR-TKI耐药之间的关系，为肺癌耐药后的治疗提供策略。

1资料与方法

1.1一般资料

收集 2017年1月至 2021年1月井冈山大学附属医院 80 例晚期肺腺癌患者，所有患者均经支气管镜或经皮肺穿刺活检获取组织标本。经基因检测为 EGFR（19 外显子或 21 外显子 L858）突变；疾病进展后再次病理活检取得足量标本。所有患者均为Ⅳ期，男性45例，女性35例，平均年龄64.8±7.4岁，两组在性别、年龄和分期方面比较均无统计学意义(P>0.05)。

1.2试剂与仪器

兔抗人Beclin1、LC3 及 P53 单克隆抗体购自（美国AB-GENT公司），羊抗兔二抗试剂盒、二氨基联苯胺 (DAB)显色试剂盒均购自（北京中杉金桥生物）,石蜡切片机、摊片烤片机 (德国莱卡公司)。

1.3操作方法

1.3.1 免疫组织化学法（SP）

样本予4％PBS固定，20％蔗糖溶液 4℃中固定过夜，放入包埋盒，脱水透明，浸腊，制作包埋块，脱蜡，抗原修复，接着封闭，抗体孵育，洗膜，滴加显色液，复染，脱水透明，封固，拍照。细胞质中有棕黄色颗粒者为Beclin1、LC3 及 P53的免疫阳性细胞，选择5个以上高倍视野进行观察，取其均值，结果判读采用阳性细胞染色所占的百分率判定。

1.3.2 RT-qPCR 检测

收集样本，使用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，并反转录得到cDNA，以此为模板进行qRT-PCR目的基因扩增，结果计算根据LC 480检测得出的CT值为cDNA荧光强度达到所设定阂值的循环数，ΔCt=目的基因CT值-内参基因CT值，每个样品中mRNA相对表达量=2-ΔCT× 100%。

2结果

2.1SP 法检测Beclinl、LC3和p53 表达结果

与靶向治疗前比较，靶向耐药后患者中Beclinl、LC3表达降低，p53 表达升高，具有统计学差异(P<0.05）见表1，表2。

表1.SP法检测Beclin1、LC3和P53治疗前后比例的变化(例 %)

表2.SP法检测Beclin1、LC3和P53在治疗前后的表达水平( ±ｓ)

2.2Beclinl、LC3和p53 mRNA表达结果

与靶向治疗前比较，在靶向治疗耐药后，Beclinl、LC3 和p53 mRNA在肺癌组织中的相对表达量比较差异均有统计学意义(P<0.05），见表3。

表3.RT-qPCR检测Beclin1、LC3和P53 mRNA表达水平( ±ｓ)

2.3 自噬相关蛋白与EGFR耐药相关性分析

采用Spearman分析软件结果表面：通过SP法与RT-qPCR法检测自噬相关蛋白表达，EGFR

耐药与Beclinl、LC3 呈负相关，与 p53呈正相关。

3讨论

靶向药物为以EGFR为靶点的晚期NSCLC患者治疗带来希望，但不同个体对EGFR-TKI疗效差异很大，几乎所有患者最终都不可避免出现EGFR-TKI耐药[3] ，探索可预测EGFR-TKI耐药的标志物对晚期NSCLC患者治疗具有重要意义。目前，关于自噬与肿瘤发生的相关性研究不断升温，为肿瘤发生和抑制生长、克服肿瘤化疗耐药性等研究提供了新思路。自噬是真核细胞内一种溶酶体依赖性的高效亚细胞降解途径，在清除废物、结构重建、生长发育、维持代谢平衡和内环境的稳定起重要作用[4]。近年来自噬异常与肿瘤的代谢、死亡及抗癌治疗的反应相联系而受到广泛关注。自噬具有不同的生物学特性，一方面可提高肿瘤细胞的适应能力，促进其生长增殖，另一方面又可诱导肿瘤细胞死亡，杀伤肿瘤细胞[5]。

自噬作为细胞程序性的死亡方式，是维持细胞内自稳的重要保护机制，其中Beclin1、LC3和p53是自噬的重要标志蛋白。Beclin1参与自噬相关信号通路调控自噬水平，其与肿瘤发生、发展有关，Beclin1基因通过与Ⅲ型PI3K形成复合体来调节其内的ATG蛋白在自噬前体结构中的定位，调节自噬活性[6]。LC3活性与细胞自噬水平呈负相关，是反映自噬活性的公认标记物，当细胞自噬过程进行到自噬泡即将闭合时，与PE结合状态的LC3定位于自噬泡膜上而发挥调节功能，能直接反映自噬水平高低[7]。P53 是一个多功能枢纽，参与很多重要的细胞增殖和凋亡过程，特别是肿瘤的形成，通过调控下游通路，促进肿瘤的发生。本研究结果显示：在靶向治疗前，自噬相关蛋白Beclin1和LC3处于低水平表达，p53高表达，而出现耐药的组织中表达水平却成相反趋势，进一步的相关性分析发现：EGFR-TKI耐药与Beclinl、LC3 呈负相关，与 p53呈正相关。我们推测在EGFR-TKI耐药组织中自噬相关基因转录减少及其蛋白表达缺失，自噬活性明显降低，自噬体形成减少，肿瘤细胞自噬功能下降、凋亡不足，导致耐药风险性增加，与张秀义等[8-9]研究类似，证明了EGFR-TKI耐药与自噬相关蛋白表达的相关性。王文涛等[10]检测72例NSCLC标本中Beclin1、LC3的表达情况，发现Beclin1在NSCLC的表达与患者的年龄及临床分期有关，而LC3在NSCLC的表达与患者的分期和肿瘤分化程度有关，且Beclin1、LC3在NSCLC中的表达呈负相关，具有一定参考意义。

综上所述，Beclinl、LC3和p53在EGFR-TKI中呈现明显相关性，提示自噬活性的改变可能与EGFR-TKI耐药有关，其具体机制仍有待进一步研究。

参考文献

[1]陈万青,等.中国肺癌发病死亡的估计和流行趋势研究[J].中国肺癌杂志,2010,13(05):488-493.

[2]Guo HS. Atg5 disassociates the V1V0-ATPase topromote exosome production and tumor metastasis independentof canonical macroautophagy. Dev Cell, 2017, 43(6): 716-730.

[3]李霞,林瑶光.自噬基因Beclin 1与肿瘤的关系[J].中国癌症防治杂志,2009,1(03):276-278.

[4] Gainor JF.Emerging paradigms in the development of resistance to tyrosine kinase inhibitors in lung cancer[J].J Clin Oncol,2013,31(31): 3987-3996

[5]张秀义,等.非小细胞肺癌中p-mTOR、Beclin1及LC3蛋白的表达及意义[J].广东医学,2019,40(07):895-901.

[6]张欣伟,王勇,等.自噬相关蛋白在EGFR-TKI耐药NSCLC患者中的表达及其相关性[J].实用肿瘤杂志,2019,34(06):508-512.

[7]Mizushima N.Methods in mammalian autophapy research[J].Cell,2010,140(3):313-326

[8]张秀义,许浩然,等.非小细胞肺癌组织Beclin1、LC3表达变化及其临床意义[J].山东医药,2018,58(48):66-69.

[9]董桂兰,等.Beclin1和LC3蛋白在非小细胞肺癌的表达和临床意义[J].实用医学杂志,2017,33(13):2097-2100.

[10]王文涛,等.Beclin1、LC3在非小细胞肺癌中的表达水平及意义[J].中国老年学杂志,2012,32(10):2055-2057.