MALDI－TOF MS在医院细菌学检验中的适宜性研究

MALDI－TOF MS在医院细菌学检验中的适宜性研究

黎荣

（重庆市黔江区疾病预防控控制中心，重庆，黔江，409000）

摘要：微生物质谱技术，又称基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－TOF MS)，作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，在近年来，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法.[1]并预计在将来取代常规病原体鉴定方法，并彻底改变微生物实验室细菌检测的面貌。

目的：虽然在国内临床微生物检验中的，MALDI－TOF MS的应用刚刚起步，但是质谱技术已经以其固有的优势进入大多数大型的医院和疾控中心的实验室，并在病原微生物检测诊断中，发挥着非常重要的作用；但是在区县一级的医疗医疗系统，基本都还没有配备MALDI－TOF MS，还在用常规的检测方法开展病原体的诊断，不但耗时耗力还效率低下，存在诸多技术上的难题，在检测人员没有丰富诊断经验的前提下，病原体误诊、漏诊的几率非常大。本综述，主要从MALDI－TOF MS技术与常规病原体生化鉴定方法的各个方面进行比较，来开展MALDI－TOF MS在医院病原体检测中适宜性研究。

关键词：MALDI－TOF MS，质谱技术，病原体快速鉴定技术，病原微生物检测

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－TOF MS)技术，其基本原理是将样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。对于微生物鉴定，需要使用m/z比在2000和20000之间的肽/蛋白质。核糖体蛋白的序列和大小在不同的细菌物种中是高度保守的，因此可用于鉴定各种类型的细菌。单个质量峰可用于微生物鉴定，并为细菌的指纹图谱提供有价值的信息。因此，本综述从可操作性，检测时效性，检测结果准确性，检测成本等多个方面对MALDI－TOF MS与常规细菌鉴定方法进行了比较，得出了MALDI－TOF MS确实具备快速、高通量、低成本和高效的优点，该技术已经彻底改变了微生物实验室中鉴定微生物的方法，完全具备取代常规细菌鉴定方法，在医院病原学检测和诊断中发挥重要作用的能力；

1 、MALDI－TOF MS与常规病原体鉴定方法可操作性上的差别

目前，常规病原体鉴定方法，确定细菌的种类的方法主要有生化学鉴定、血清学鉴定和核酸检测、基因测序等多种手段，利用这些手段鉴定细菌的前提均要求实验人员能够分离到细菌非常纯，这不但要求我们的医生有丰富的经验能够判断病人感染的细菌的大致种类，还需要我们的实验人员能够选择合适的培养基对细菌进行选择性培养，并能够在平板上精准找到特征性的菌落，对实验人员的操作能力和经验要求非常高；而MALDI－TOF MS对检验人员的的要求不高，只需要用普通的培养基如营养琼脂平板、血琼脂平板、沙氏琼脂将单个菌落分离出来即可即可，除分枝杆菌属和丝状真菌通常需要多步提取以确保生物蛋白质组的质量外，其他细菌均可以直接涂抹在MALDI靶的薄膜上放入样品仓内进行检测，仪器的操作也非常简单，对点样的部位用激光进行照射，细菌的各蛋白组分发生电离，根据各蛋白质组分的质荷比（m/z）得到细菌的蛋白图谱，与参考细菌图谱进行比较，便可得到细菌的鉴定结果。

2、MALDI－TOF MS与常规病原体鉴定方法检测时效性上的差别

在实践中，微生物检测方法有很多，通常采用培养法，取样，于培养基中培养，进行观察计数，确定食品是否受微生物污染以及受污染的程度。但是，这种检测方式需要的时间较长（通常需要 2 ～ 3 d，有时甚至更长），这与现代食品生产的快节奏明显不符。

常规病原体鉴定方法主要基于染色镜检、生化培养、血清凝集这些表型测试技术对细菌进行鉴定，这些方法通常很耗时，通常需要8-48个小时，甚至更长时间，费时费力，物种鉴定结果可能也不准确。与细菌的表型测试相比，分子生物学技术更具准确性，正在逐步被人们开发和使用，但仍然存在耗时，昂贵且工作量大等问题，无法满足微生物学中快速诊断的目的。MALDI-TOF MS仅需少量的微生物（104~105个细菌）就可以在几分钟内对大量菌种进行鉴定，非常快速；

3、MALDI－TOF MS与常规病原体鉴定方法检测结果准确性上的差别

慎 慧 ，黄媛媛 ，何丽华 ，倪丽君等分别使用mieroTyperMS型质谱仪 (厦门质谱公司)，MALDITOFIVD MBT型质谱仪 (布鲁克公司)，Autofms1000型质谱仪 (安图生物公司) 3套MALDI—TOFMS系统对菌株进行鉴定 ，其中对标准／质控 菌株 (除外厌氧茵 )的鉴定符合率为 100％； 对临床菌株的属水平鉴定 阴／阳性杆菌的种水平鉴定符合率分别为 100％、100％、96．77％；对革兰阳性球菌的种水平鉴定符合率分别为96．67％、96．67％、100％；对真菌的种水平鉴定符合率均为 90％一致；对苛养茵的种水平鉴定符合率均为 100％；对厌氧菌鉴定符合率为 91．67％种 水平一致 。精密度验证试验 结果重复性 100％。3种 MALDI—TOFMS 系统在革兰Fn／阴性球菌、革兰阳／阴性杆菌、真菌、苛养茵鉴定的准确度和精密度符合要求，验证通过。本文建立的微生物鉴定质谱 仪性能验证方案 可满足综合性医院临床微生物实验室常规鉴定基本要求。

[3]特别是与目前实验室常用的VITEK 2生化鉴定系统的比较上，屠博文，史伟峰等同步使用VITEK2和 MALDI-TOF质谱鉴定院内感染致病菌，通过与基于生化鉴定为基础的VITEK 2同步鉴定比较，证明了MALDI－TOF MS微生物鉴定系统无论在鉴定时间，准确率与鉴定率都具有显著的优势。[4]

4、MALDI－TOF MS与常规细菌鉴定方法检测成本上的差别

目前，市面上常见的MALDI－TOF MS主要有布鲁克公司，安图生物公司，厦门质谱公司以及中元生物的质谱仪，设备价格基本都在100-180万元不等，与常规病原体生化鉴定方法用到的设备比起来，价格要高出许多，但是检测MALDI－TOF MS主要用到的试剂比如甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂都非常便宜，大致为5元/人份，比常规病原体鉴定方法用到的生化鉴定试剂、血清、核酸鉴定试剂盒的成本低的多；检测用到的金属靶板也可以反复使用，不需要重复购买；常规病原体鉴定方法对比MALDI－TOF MS鉴定病原微生物的检测成本相对高昂得多。

5、MALDI－TOF MS与常规病原体鉴定方法解决检验难题的能力

常规的微生物鉴定方法主要是基于表型的检测，包括革兰染色、微生物培养和生化试验等，因时间较长、鉴定范围窄，影响了病原微生物鉴定的速度和准确性，在一定程度上阻碍了感染性疾病的控制。目前MALDI－TOF MS已应用于细菌和真菌的鉴定，其在微生物耐药性分析、分型和毒力研究等科研领域的应用也初有成效，尚有巨大的发展空间,MALDI－TOF MS的应用解决了常规病原体鉴定方法很难解决的诸多难题，主要体现在如下方面；

（1）、常规病原体生化鉴定方法往往只能将细菌鉴定到属或群，要将细菌鉴定到具体的种必须依靠血清学试验（如沙门氏菌），PCR试验(如粘度较高的部分大肠埃希菌)，或者加做其他生化学试验（如阴沟肠杆菌科复合群），有的细菌甚至需要用细菌16SDNA基因测序才能确认，时间长，成本高；但MALDI－TOF MS的数据库相较常规生化鉴定用的VITEK2生化鉴定系统的数据库检索到的细菌种类要多的多，而且每年都在随着方法的改进和完善，MALDI－TOF MS对细菌的基本能能够满足临床病原微生物的检测【5】。

（2）、在医院常见的死亡率较高的血液感染检测中，常规的血培养方法耗时耗力，无法准确地将鉴定结果报给临床病房，及时指导正确用药。相反地，MALDI－TOF MS可以大大缩短 TTP 及 TAT，

对于临床有着重大意义。同时，利用 SDS 进行前处理阳性血培养原液，阳性符合率较高。若进一步结合革兰染色快速镜检，阳性率将大大提高【6】。有文献表明MALDI-TOF 质谱仪仅需约 30 min 就得到准确细菌鉴定结果[7]。

(3)、近年来，深部真菌感染发生率和病死率在逐年增加,其中以白色假丝酵母为主，其他酵母菌样真菌也频繁被检出。传统的真菌鉴定方法主要有 CHROMagar显色培养基和生化鉴定系统如API2OC、全自动微生物鉴定仪 Vitek、Microscan 及 Biolog鉴定系统等，这些检测需较长周期和较高成本，难以鉴定不常见或生化反应相近的真菌；分子学鉴定方法(如荧光杂交和PCR) 快速、准确，但对实验室要求较高，难进行推广【8】。MALDI-TOFMS将待测真菌样本制备好以后即可上机进行检测。待测样本经质谱分析后获得特定的质谱图，与数据库中的参考光谱比对就可明确样本菌的种类。。最近研究表明，MALDI-TOFMS除了可以准确鉴定丝状真菌之外，还具有对丝状真菌进行分型的潜力【9】。

（4）、病原菌能够入侵宿主体内并产生致病物质造成宿主感染 , 耐药菌的出现更是严重影响了患者的生活质量和临床微生物的检验 和治疗进程 。目前，常规的生化鉴定不能检测细菌是否为耐药菌，必须依靠药敏试验才能确定。 MALDI-TOF MS通过对血培养阳性标本 、尿路感染标本和呼吸道感染标本中病原菌的鉴定 ,并将耐药菌的检测按是否借助抗菌药物分为直接检测和间接检测两方面 ,检测耐药菌的特征峰 、所产酶和细胞组分的方法为直接检测 , 通过加入抗菌药物以检测耐药菌的方 法为间接检测 。MALDI-TOF-MS在病原菌鉴定和耐药菌检测方面有良好的效果 , 凭借其操作简便 、省时 、精确 、高通量 、低成本等优势 ,在未来同样具备很大的潜力 。各实验室应建立符合自己实验室的 MALDI-TOFMS 检测体系 ,规范标本前处理 、基质选择等 , 缩短检测周转时间 ,为临床提供 准确的检验报告 , 指导感染患者的救治【10】 。

但是，现阶段MADLI-TOF MS 在微生物鉴定中还存在一定的局限性，如微生物蛋白指纹图谱数据库不够完善， 一些罕见菌种或新型细 菌的图谱尚未被现有数据库收录，从而导致鉴定 困难；含有混合菌种的血培养样本难以准确鉴别； 同一菌属中相近的菌种容易错误鉴定；直接鉴定时，血培养和尿液样本中菌量对鉴定的影响；以及 临床实验室间由于培养习惯(培养基、培养时间、培养温度等)的差异对实验重复性的影响，这些问题都亟待解决。

综上所述，虽然 MADLI-TOF MS 设备的价格较高，但以其快速、准确的特点，可以以最快的速度给出检测结果，指导临床用药；以简单、自动化、高通量、检测成本低的特点，大大的降低包含人工和试剂、耗材在内的降低检测成本；还可以以其特殊的检测方法，解决常规病原体鉴定方法难以解决的检验难题；或许我们可以通过完善数据库、规范微生物的前处理、建立标准的检测流程提高准确性，还可以与部分常规方法相结合，最大程度上发挥蛋白质谱技术的作用。与此同时， MADLI-TOF MS 已在微生物相关研究中崭露头角，它在今后的科研应用中还有很大的提升空间， 有望在微生物耐药机制研究、细菌毒力因子研究、 亚型分型等方面发挥更大的效用。随着蛋白质谱技术的不断发展，相信在不久的将来，它一定会成为微生物鉴定和科研领域的一大支柱。

【1】上海市医学会检验分会临床微生物组学，倪语星等，MALDI－TOF MS病原体鉴定质量保证专家共识，中华检验医学杂志【J】, 2018,41(8): 567-570.

【2】王淑娴，刁菁，樊英，李乐，刘洪军，叶海斌;质谱技术在微生物鉴定和检测中的应用 ,河北渔业【J】,2019年第10期：37-40。

【3】徐蓉，慎慧，黄媛媛，何丽华，倪丽君等，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱微生物鉴定系统能验证方案的建立，临床检验杂志 【J】，2018年 l0月第 36卷第 10期：783-787。

【4】屠 博 文 ，史伟峰等MALDI—TOF质谱院内感染致病菌检测中的应用，重庆医学【J】， 2015年 11月第 44卷 第 33期：4665-4670

【5】戴颖欣、李敏，MALDI-TOF - MS 在临床微生物检验中的应用，检验医学【J】,2015年2月第30卷第2期:102-107

【6】金秀秀 ，张亚彬 ，MALDI-TOF 质谱仪在血培养中的应用，中国当代医药【J】 ,2023 年 3 月第 30 卷第 8 期：167-172

[7]陆燕飞，刘根焰，张晓慧等，质谱快速鉴定联合直接药敏试验在肠杆菌目细菌血流感染诊断中的应用评估[J]. 临床检验杂志，2021，39（11）：822-827.

[8]梁铮,柏彩英等,MALDI-TOF-MS技术快速鉴定临床酵母样真菌的应用评价【J】,检验医学与临床2015年9月第12卷第18期:2659-2660

【9】LauAF,DrakeSK,CalhounLB,etal.Developmentofaclinicallycomprehensivedatabaseandasimple   procedureforidentificationofmoldsrom solid mediabymatrix-assistedlaserdesorptionionization- timeofflight massspectrometry[J].JClinMicrobi- ol,2013,51(3):828-834.

【10】张雅静 ,李劭昱，MALDI-TOFMS在常规标本病原菌鉴定和细菌耐药性检测中的应用及进展【J】,国际检验医学杂志 2022年6月第43卷第1期 :1383-1389