浅析多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

浅析多重PCR快速检测3种致泻性大肠埃希菌方法的建立

曲桂娟 

内蒙古赤峰市疾病预防控制中心  024000

摘要：目的  分析3种致泻性大肠埃希菌应用多重PCR检测技术的效果，其中包含肠致病性大肠埃希菌（EPEC）、肠出血性大肠埃希菌（EHEC）以及肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）。方法  将三种大肠埃希菌基因特征作为根据设计引物，构建PCR多重检测系统，同时完善PCR反应条件。结果  PCR3组引物可以对相应的目的基因进行特异性扩增，这一多重检测系统同时可以针对3种目的菌实时检测，并且具有较高特异性。结论  可以同时针对3种致泻性大肠埃希菌进行检验多重PCR检测系统已经形成，可以在食品安全和食物中毒事件中加以应用。

关键词：多重PCR快速检测；3种致泻性大肠埃希菌；系统建立

肠道腹泻性疾病在世界范围内较为常见，主要感染致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli, DEC)所致[1]。将不同致病机制作为根据进行分析，发现致泻大肠埃希氏菌种类较为丰富， 爆发致泻大肠埃希菌的主要因素同时包含接触传播、食源性传播以及水源新传播[2]。此菌种在自然界中的分布较为广泛，水源以及食物受到污染后，将会导致大范围水源性腹泻或者细菌性食物中毒，现阶段，国内在影响国人卫生健康的12种因素中纳入EHEC[3]。以往判断及治疗致泻肠道埃希菌的方式主要为分离培养、血清实验分型以及生化检验等，不仅需要较长的试验周期，并且可能存在一定误差，影响细菌鉴定的准确性。

1 资料与方法

1.1菌株及来源

准备3种大肠埃希菌作为阳性目的菌株，另外分别准备伤寒沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌作为阴性参照。

1.2 仪器与试剂

本次实验器材分别为常规PCR仪（C1000 Touch）、Gel Doc XR+凝胶成像系统以及Wide Mini-Sub Cell GT型水平电泳系统。试剂盒由宝生物提供的通用型试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 菌株复苏与核酸提取

将菌株置于37 ℃的营养肉汤进行复苏处理，待18小时候根据核酸试剂盒使用说明提取细菌DNA。

1.3.2 引物设计与生成

检测EPEC 时将eae基因作为靶基因；检测EIEC时将ipaH当作靶基因；检测EHEC时将stxl当作靶基因，对比后设计引物时考虑保守区域，引物序列表如表1所示：

表1 　PCR 引物序列表

1.3.3单重 PCR 扩增

通过三种肠道致泻性埃希菌菌株作为样本，PCR对其目的基因进行扩增，验证设计引物。 PCR 扩增反应体系 ：总体积25μL ，含2μL的DNA 样本 、2.5μL的10×PCR 缓冲液 、2mmol/L的氯化镁（MgCl２）、50nmol/L引物 、0.2mmol/L 的三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP）、2U的Taq DNA 聚合酶.反应条件 ：95℃预变性5min ，94℃变性60s ，55℃退火60s ，72℃延伸60s ，共35个循环 ；最后72℃延伸10min。使用2%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳处理，同时对其准确性实施测序验证。

1.3.4完善多重PCR条件

将各引物以1:1:1的比例进行混合，应用50μL的扩增体系，含5μL的DNA样本、5μL的10×PCR缓冲液、5mmol/L的MgCl2、100nmol/L引物（每条）、0.5mmol/L的dNTP，5U的TaqDNA聚合酶。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环；最后72℃延伸10min。针对扩增产物实施电泳处理时，琼脂糖凝胶浓度应保持在2%左右。

2 结果

2.1 单重PCR结果及引物特异度检测

将3种阳性DEC菌株作为样本对目的基因进行扩增，可以获得特异扩增条带，产物大小符合理论基础，测序结果能够和目的基因保持统一，由此可见设计引物能够保证扩增后的目的片段准确性。

2.2 多重PCR结果和特异度验证

根据1:1:1的比例针对引物进行混合，完善PCR扩增条件，并将以上阳性菌株及其他菌株DNA作为样本，实施多重PCR扩增，正如图1所示，阳性菌株能够扩增对应的目的片段，结果和单重PCR保持统一，剩余菌株则呈阴性反应。

图1 多重PCR扩增结果

3 讨论

现阶段，通过PCR检测技术能够有效区分大肠埃希菌的致病型别，主要方法包含多重荧光PCR、单重普通PCR以及多重普通PCR等[4]。其中多重普通PCR检测能够同时针对多重致泻性大肠埃希菌进行检测分型，并且可以针对不同致病型别的菌株进行分类，不仅具有较高准确性，同时具有简单易操作，节省时间成本等优势，检测时间不会超过24小时，能够在食品生产销售及质量检测提供关键的技术支持。

参考文献

[1] 刘莉,魏海燕,王紫薇,等. 3种方法检测食品中致泻大肠埃希氏菌检测能力验证结果分析[J]. 食品安全质量检测学报,2020,11(17):6086-6092.

[2] 周杨,万强,蔡芷荷,等. 3种致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测试剂盒的研制与效用评价[J]. 现代食品科技,2020,36(12):243-251.

[3] 张明明,梁美丹,黄志深,等. 6类致泻大肠埃希氏菌多重PCR检测体系的建立[J]. 食品安全质量检测学报,2019,10(14):4667-4672.

[4] 胡安妥,王娉,张彩霞,等. 5类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立[J]. 食品科学,2018,39(22):249-255.