实时荧光定量PCR技术在人类细小病毒B19检测中的应用

实时荧光定量PCR技术在人类细小病毒B19检测中的应用

房嫱

上海市静安区闸北中心医院   上海   200070

摘要：目的：分析实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）在人类细小病毒B19（HPV B19）检测中的应用价值。方法：选取我院2022年6月至2023年6月移植术患者50例标本组织，分别通过FQ-PCR技术与PCR技术对HPV B19进行检测，分析FQ-PCR在HPV B19中的应用价值。结果：PCR技术检测显示阳性例数18例，阳性率为36.00%；FQ-PCR技术检测显示阳性例数28例，阳性率为56.00%。FQ-PCR技术检测HPV B19的阳性率明显高于PCR技术，差异有统计学意义（X2=4.026，P=0.045）。FQ-PCR检测结果显示，1×104~1×105copies/ml共21例，占比42.00%；＞1×105copies/ml共7例，占比14.00%。结论：PCR技术在HPV B19的检测能够得到较为可靠的结果，但仅为定性结果，且检测操作复杂、时间较长。相比之下，FQ-PCR技术具有操作简单、快速、灵敏度高、稳定性强、可定量分析等优势，值得在临床推广应用。

关键词：实时荧光定量PCR技术；细小病毒B19；聚合酶联反应

临床中检测HPV B19的方法较多，其中PCR技术应用最为广泛，传统的PCR技术检测HPV B19具有特异性强的优势，但检测流程较为繁琐，一旦出现失误就有可能导致交叉污染，同时该技术只能对结果进行定性检测，存在一定的缺陷[1]。相比之下，实时荧光定量PCR技术则具有简单、高效、灵敏度高、特异度高的优势[2]。本次研究分析了FQ-PCR在HPV B19检测中的应用价值，具体报告如下。

1. 资料与方法

1.1基本资料

选取我院2022年6月至2023年6月移植术患者50例标本组织，患者年龄20-38岁，平均年龄（28.46±3.31）岁。

1.2方法

1.2.1标本处理

将临床中收集到的组织置入高压消毒的生理盐水中进行洗涤，循环3次。随后装入无菌密封袋中，置入液氮中，持续24h，随后在-70℃环境下进行保存。

1.2.2 PCR检测

PCR检测的反应条件如下：94℃预变性300s，94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，随后72℃延伸300s。每次反应后均以蒸馏水作为阴性对照组。结果判定标准如下：选择扩增产物2μL，通过2%琼脂糖进行电泳处理，标本若在400hp水平位置出现红橙色荧光，则可判定为阳性，否则可判定为阴性。随机选择2例阳性产物纯化后进行测序，对扩增的特异性进行分析。

1.2.3 FQ-PCR检测

每个标本由同一名检验人员进行操作，至少进行2次FQ-PCR检测。取已提取的模板2μL，选择人类细小病毒B19荧光定量PCR试剂盒，反应条件如下：93℃预变性120s，93℃ 15s，55℃ 30s，共30个循环。每次反应设置阴阳性对照各1个，以及3个定量阳性对照组。若吸纳是DNA拷贝数≥1×104copies/ml，则可判断为阳性。

1.3统计学分析

通过SPSS22.0软件进行统计学分析，计数资料通过率（%）表示，采用X2检验。若P＜0.05，则对比具有统计学意义。

2. 结果

2.1检测结果

PCR技术检测显示阳性例数18例，阳性率为36.00%；FQ-PCR技术检测显示阳性例数28例，阳性率为56.00%。FQ-PCR技术检测HPV B19的阳性率明显高于PCR技术，差异有统计学意义（X2=4.026，P=0.045）。

2.2FQ-PCR病毒载量分布

FQ-PCR检测结果显示，1×104~1×105copies/ml共21例，占比42.00%；＞1×105copies/ml共7例，占比14.00%。如下表1所示：

表1 FQ-PCR病毒载量分布（n=50）

3. 讨论

目前临床中检测HPV B19的方法较多，根据类型可分为血清学、分子生物学与组织学3类，其中血清学检查以ELISA技术为主，分子生物学以PCR技术为主。但HPV B19无法在普通培养基上生长，抗原制备的难度较大，严重限制了血清学诊断的应用，因此基因检测是目前临床诊断HPV B19感染的主要方式[3]。

PCR技术最早于19世纪末期用于对HPV B19的检测，近年来FP-PCR技术得到了广泛的应用，该技术融合了PCR技术与DNA探针杂交技术，是一种新型的基因检测方法。PCR技术的操作较为复杂，一旦出现人为失误就可能引发交叉污染，而FQ-PCR仅需要检验人员在加样时打开反应管，基因扩增与产物分析的整个过程均在单管封闭的条件下完成，有效避免了交叉污染的发生。同时，对结果的分析方面，PCR技术主要通过电泳反应进行定性分析，而FQ-PCR技术则通过分析软件对结果进行分析，省略了传统的电泳步骤，对检验人员具有一定的保护作用

[4]。另一反面，FQ-PCR技术的整个过程由电脑进行控制，反应条件一致，检测结果较为可靠，能够通过荧光信号的强弱情况计算原始模板的量化结果。本次研究结果显示，PCR技术检测显示阳性例数18例，阳性率为36.00%；FQ-PCR技术检测显示阳性例数28例，阳性率为56.00%。FQ-PCR技术检测HPV B19的阳性率明显高于PCR技术，差异有统计学意义（X2=4.026，P=0.045）FQ-PCR检测结果显示，1×104~1×105copies/ml共21例，占比42.00%；＞1×105copies/ml共7例，占比14.00%。。由此可以看出，FQ-PCR的灵敏度更高，且具有良好的重复性，能够根据病毒载量对患者的病情进行准确的评估，掌握HPV B19感染的具体情况与疾病进展，不会受到反应体系扩增效率的影响，稳定性更强。

综上所述，PCR技术在HPV B19的检测能够得到较为可靠的结果，但仅为定性结果，且检测操作复杂、时间较长。相比之下，FQ-PCR技术具有操作简单、快速、灵敏度高、稳定性强、可定量分析等优势，值得在临床推广应用。

参考文献

[1] 刘彬,朱丽媛,叶祥忠,等. 人类细小病毒B19核酸检测方法的建立及方法学验证[J]. 中国药品标准,2022,23(2):161-168.

[2] 许良云,张其刚,范广来,等. 人微小病毒B19荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立[J]. 实用临床医药杂志,2021,25(7):11-14,20.

[3] 王艺静,江华,张曦,等. 襄阳市育龄妇女血清B19病毒DNA的检测[J]. 公共卫生与预防医学,2020,31(6):91-95.

[4] 刘晓庆,龚甜,李健雄,等. 江西省1778例细小病毒B19抗体水平检测结果分析[J]. 实验与检验医学,2022,40(6):749-751.