衍生化液相色谱专利技术

(整期优先)网络出版时间:2023-12-09
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衍生化液相色谱专利技术

张钰   杨利   韩毓杰  周蓉

国家知识产权局专利局专利审查协作湖北中心

摘要:衍生化液相色谱是指在一定条件下利用化学衍生试剂与样品组分在色谱分离之前或分离之后发生化学反应,从而使得反应产物有利于色谱检测或分离,本文对衍生化液相色谱领域的专利技术进行了分析。

关键词:衍生;液相色谱;专利

引言

液相色谱是一类分离与分析技术,近年来,随着液相色谱技术的发展,但迄今为止,高效液相色谱还没有一个通用型高灵敏度检测器,许多异构体也不易色谱分离。为了扩大液相色谱的适用范围,提高检测灵敏度和改善分离效果,采用衍生化法是一个行之有效的途径。衍生化是借助化学反应给待测物质接上某个特定基团,从而改善待测物质的液相色谱检测性能和分离效果。

1.衍生化液相色谱基本理论概述

衍生化液相色谱是指在适当的可行条件下,使实际样品中的待测物质与具有特定官能团的化学衍生试剂发生化学反应,即将难于分析的待测物进行化学修饰从而转化为结构类似的化合物的样品前处理方法。从而使待测分析物具有特定的功能基团。通过衍生化方法产生的新的物理和化学性质使待测物更适合分析检测,提高分析检测结果的准确性,可用于量化或分离。当待测组分不能被有效检测时(无紫外、荧光或质谱响应),需要对其进行衍生化处理(例如修饰生色团等),生成易被检测的化合物。

化学衍生化的目的主要有:(1)提高检测灵敏度;(2)改善分离度;(3)易于进行结构鉴定。化学衍生化反应满足的要求主要有以下四点:(1)反应条件不能过于苛刻;(2)反应能够迅速定量进行;(3)待测组分发生反应后只能生成一种可被检测的衍生产物,反应产生的副产物及反应剩余的衍生试剂不会对衍生产物的分离检测产生干扰;(4)衍生试剂易获得,适用性强。

按照检测器类型及检测所达到的目的,衍生化液相色谱可分为质谱衍生化、荧光衍生化和紫外衍生化。其次,对于难以色谱分离的物质,也可以通过衍生化来提高液相色谱分离度,尤其是对于对映异构体的色谱分离。同时,衍生化液相色谱仪器也在不断发展,便于液相色谱分析时的衍生化处理。

2.衍生化液相色谱专利申请量

从2001年至2009年,衍生化液相色谱相关技术基本上处于萌芽时期,这个时期的衍生化液相色谱以荧光衍生化、紫外衍生化以及衍生化液相色谱仪器为主,衍生化试剂数量也比较少。在2010年至2014年,衍生化液相色谱处于成长期,该领域的专利申请量整体呈现上升趋势。在2015年后,该领域的专利申请量迎来了发展高潮,专利申请量呈急速上升的态势,直到2018年达到顶峰,在2019年出现一定程度的回落,2019年至今其申请量维持一个稳定状态。

3.衍生化液相色谱技术路线梳理

衍生化液相色谱技术有着巨大的应用空间,按照应用分,主要由以下几大技术路线:衍生化液相色谱紫外检测技术、衍生化液相色谱荧光检测技术、衍生化液相色谱质谱检测技术、衍生化液相色谱对映异构体检测技术。

3.1衍生化液相色谱紫外检测

紫外衍生即加入发色团使正常形式下不能被检测的物质能够检测。发色团应具有较大的摩尔吸收系数,使其吸收光谱能尽量提高检测灵敏度,使背景噪音变小。一般情况下用于紫外衍生的试剂要有两个重要的官能团。第一个用于控制试剂与被测物反应,第二个用于紫外检测,即发色团,用于增强待测物质的紫外吸收,提高紫外检测的灵敏度。液相色谱紫外检测技术成熟、应用广泛,且紫外检测器相较于质谱检测器更加便宜,因此其申请量是最多的。

专利文献CN101603952B、CN101701941A和CN101876650B均以2,4-二硝基苯肼衍生化香烟相关对象中的羰基类化合物,并对生成的苯肼类物质进行液相色谱紫外检测。其中,CN101876650B公开了一种衍生化液相色谱紫外检测甲醛的方法,甲醛的紫外吸收较弱,不利于液相色谱紫外检测,该文献利用2,4-二硝基苯肼对烟用水基胶中的甲醛进行衍生,反应产物甲醛-2,4-二硝基苯腙在352.0nm处有较大的紫外吸收,利用高效液相色谱仪配合紫外检测器对待测样品溶液进行分析检测,得到烟用水基胶中甲醛的含量。甲醛的衍生产物色谱峰(甲醛-DNPH)与杂质色谱峰分离较好,检测时间只需要10 min,且该方法的灵敏度较高。

其次,CN109187817A公开了以1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生血清中的游离的甘露糖和葡萄糖,并通过液相色谱紫外检测,为寻找疾病检测标记物提供帮助。柱前PMP衍生血清中的游离的甘露糖和葡萄糖,并通过液相色谱紫外检测,用于鉴定急性淋巴癌的生物标记物的定量分析。甘露糖和葡萄糖的紫外吸收较弱,而其与PMP的衍生产物,在254 nm处有较大的紫外吸收,提高了检测的灵敏度,因此所需要的血清用量少,每次只需小于1mL的血量。建立了正常人和急性淋巴癌患者血清游离甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值构建的三维立体图,检测并计算血清中游离的甘露糖、葡萄糖及葡萄糖与甘露糖浓度的比值可以区分正常人和急性淋巴癌患者,适合临床上用于急性淋巴癌患者的诊断。

3.2衍生化液相色谱荧光检测

液相色谱的荧光检测器比紫外检测器灵敏度更高。具有强紫外吸收的化合物检测灵敏度可达10-9mol/L水平,而荧光衍生物的检测水平一般为10-12-10-14mol/L水平,灵敏度比紫外检测器提高10-100倍。液相色谱结合荧光检测方法所具有的高选择性、高灵敏度以及试样用量少的特性,使得其对各种复杂生物样品中的分析物测定变得更加灵敏、准确、快速。但荧光检测器要求被检测样品能被激发产生荧光。对于荧光较弱或不产生荧光的样品灵敏度则很低,甚至不能被检测。为了扩大检品范围,提高检测灵敏度,常采用荧光衍生法。

JP2009036685A公开了通过精氨酸/硼酸反应产生荧光衍生物的还原糖分析方法。样品通过柱4以分离还原糖,然后在反应罐8中与包含精氨酸和硼酸的反应溶液反应以产生荧光衍生物,该荧光衍生物由荧光检测器10通过液相色谱法检测。在还原糖分析方法中,使用酸性缓冲溶液作为洗脱液,并向反应溶液中加入足以中和酸性缓冲溶液的氢氧化钠等。根据该方法,即使洗脱液是酸性的,反应过程中溶液的pH也变为碱性,因此可以通过精氨酸-硼酸反应生成荧光衍生物。

其次,专利文献CN107807112B、CN108088822B、CN109387576A、CN109839464A、CN110763789B均采用衍生化液相色谱荧光检测技术。其中,CN110763789B公开了一种检测食品基质中黄曲霉毒素的前处理方法,采用三氟乙酸衍生黄曲霉毒素,用高效液相色谱-荧光检测在等度条件下实现对于食品基质中黄曲霉毒素的分离检测。黄曲霉毒素G1,黄曲霉毒素B1,黄曲霉毒素G2,黄曲霉毒素B2,均得到了有效的分离和检测,该方法简单快速,衍生效率高,能够实现对于各种食品基质黄曲霉毒素准确的定性定量,满足研究和检测的需要。同时,CN109387576A公开了可广泛用于高效液相色谱(HPLC)-荧光检测法定量检测黄曲霉毒素和磺胺类药物的光衍生化器。采用波长为280~370nm的紫外LED光源代替传统的低压汞灯作为激发光源;简单的阿基米德螺旋形缠绕在反光碗内壁表面代替传统的“蜂窝编制”结构的衍生反应管;通过对衍生反应管的改进和优化,可以使黄曲霉毒素G1的荧光强度提高7倍,使黄曲霉毒素B1的荧光强度提高5倍,体积更小,显著地降低色谱峰展宽。

3.3衍生化液相色谱质谱检测

液相色谱-质谱法中,化学衍生化能够最大限度的提高HPLC-MS的检测能力。基于液相色谱-质谱法的衍生化技术为解决许多分析检测难题提供了行之有效的解决方案,质谱检测的适用范围广,灵敏度比紫外检测高,且其定性能力比紫外和荧光检测更强,在2000年以后,衍生化液相色谱质谱检测的申请量逐渐增多,且近几年仍然处于火热发展的阶段。

专利文献CN103698414B、CN103822998A、CN105301119A、CN107290459B、CN107782834B、CN111239312A和CN111983044A均采用了衍生化液相色谱质谱检测技术分析生物样本中的物质。其中,CN111983044A公开了一种基于双衍生处理分析甾体激素的检测方法,采用甲氧胺作为衍生试剂衍生含羰基的甾体激素,丹磺酰氯衍生含有酚羟基的甾体激素,衍生产物混合后用于液相色谱串联质谱分析,可同时高灵敏检测含有羰基或酚羟基的甾体激素,涵盖雄激素、雌激素、孕激素和皮质激素等。

同时,质谱是一种高灵敏度高选择性检测的仪器,传统的化学衍生化技术与液相色谱-质谱法相结合提高了检测的灵敏度,但仍然受很多因素的制约,待测物中所含化合物种类较多,基质复杂,不易定性检测,质谱信号易受复杂基质的干扰,分析物定量检测时必须加入同位素内标物。但是,并不是所有化合物的同位素内标物都是商品化易获得的,合成同位素内标物又是十分困难的。稳定同位素标记衍生化作为一种可选择的技术出现的出现解决了这些困难。通过稳定同位素衍生化试剂分别衍生细胞中的半胱氨酸,利用 MS 对混合后的标记样品分析检测。样品中相同待测物会因为同位素标记衍生化而出现两种容易分辨的峰,从而对待测物进行检测。例如CN105301119A公开了基于两端非等重标记的蛋白质氨基酸序列从头测序方法,通过对多肽的N端和C端分别进行稳定同位素标记以鉴别碎片离子的蛋白质氨基酸序列从头测序方法。以胞内蛋白酶赖氨酸-C对变性还原烷基化后的蛋白质进行酶切,形成含有N端α-氨基和C端赖氨酸侧链ε-氨基的肽段。具体的流程为,样品分成两份后,使用含有不同同位素的标记试剂对多肽N端α-氨基进行选择性衍生;再使用含有不同同位素的标记试剂对多肽C端赖氨酸ε-氨基进行衍生或者在培养细胞时,使用含有同位素标记赖氨酸的培养液来实现对蛋白质中赖氨酸的标记。最后,将样品混合,使用高效液相色谱-质谱进行分离和鉴定。本发明通过标记形成成对存在的多肽碎片离子而加以分辨,降低干扰信号的影响,提高碎片离子选择特异性和多肽测序准确度;提高从头测序的速度。

3.4衍生化液相色谱对映异构体检测

衍生化可以利用化学变换将难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质,利用衍生化法能够改善被测组分的色谱行为,例如通过衍生化提高待测对映异构体的分离度,在非对映环境下实现对映异构体的分离,提高液相色谱法对对映异构体分离的能力。

专利文献CN105699509B、CN105510263B、CN105675783B和CN105510509B均公开了将衍生化液相色谱技术用于对映异构体的检测方法。其中,CN105510509B公开了一种3-氨基哌啶对映异构体过量率的测定方法,以(R)-(+)-1-苯基乙磺酰氯为衍生化试剂,通过控制反应条件,(R)-(+)-1-苯基乙磺酰氯选择性与3-氨基哌啶的伯胺反生反应,即控制3-氨基哌啶和(R)-(+)-1-苯基乙磺酰氯的摩尔比,进行单衍生化反应,得到衍生化后的3-氨基哌啶,建立了衍生化后的3-氨基哌啶的定性、定量和和对映体过量率。

其次,专利文献CN104502470B、CN104529710B、CN111896650A和CN111999416A均公开了利用手性衍生试剂柱前衍生高效液相色谱拆分手性醇类物质异构体的方法。其中,CN111999416A公开了一种手性衍生试剂柱前衍生高效液相色谱拆分R/S-N-Boc-哌啶醇的方法,:先将R/S-N-Boc-哌啶醇与(+)-萘普生经过酯化反应得到(+)-萘普生-R/S-N-Boc-哌啶醇酯;再采用高效液相色谱仪,以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱,用水相和有机相作为流动相,将R/S-N-Boc-哌啶醇分离。采用廉价(+)-萘普生作为手性衍生试剂与R/S-N-Boc-哌啶醇反应,使得衍生物具有较强的紫外吸收,在广泛使用的紫外检测器中检测时,具有较高的灵敏度;并且选用(+)-萘普生作为衍生试剂只需采用一般的C18色谱柱就可对衍生物进行分离检测,而非使用填料昂贵的手性色谱柱。

4.总结

本文对衍生化液相色谱领域的相关专利技术进行了分析,衍生化液相色谱是液相色谱分析的重要手段,能够提高检测灵敏度,改善分离度,有利于进行结构鉴定,其发展对液相色谱分析检测有着重要意义。