热应激对猪新鲜精液质量和功能的影响

热应激对猪新鲜精液质量和功能的影响

麦剑明1 何展发2

（1廉江市雅塘镇农业技术服务中心 ，广东廉江，524455

2廉江市石角镇农业技术服务中心，广东廉江，524462）

摘要：。随着市场的需求发展，精液可能需要在不同的区域之间进行快速运输。本研究旨在通过模拟精液可能遭受的环境温度以及运输过程中温度的变化，明确猪精子质量和功能受到的影响以及精浆和精子中含有的抗氧化物质是否有利于精子对抗热应激造成的损伤。

关键词：热应激；新鲜精液；功能

1引言

目前关于精液运输过程对猪精子质量的影响研究甚少。由于公猪精液的生产呈现集中化趋势，精液运输过程将在人工授精过程中扮演着重要的角色。近年来国内外对动物应激领域的研究取得了一定的进展，但是热应激仍然在夏季影响动物福利、降低生产力。本研究旨在阐明热应激对猪精子的繁殖力和各项指标的影响及危害，提醒人们需采取合理有效的对策以及对此情况的重视，防止应激的产生，减少损失。

2材料与方法

人工授精作为种重要的繁殖技术，其在畜牧生产及濒危动物保护等多个领域得到了广泛应用。鉴于人工授精技术的成熟性和众多优点，近年来在畜牧生产中使用人工授精的比例急剧增加，在养猪业中尤为明显。本研究旨在通过模拟精液可能遭受的环境温度以及运输过程中温度的变化，明确猪精子质量和功能受到的影响以及精子和精浆中的抗氧化物质是否有利于精子对抗热应激造成的损伤。

2.1试剂与仪器

2.1.1.精液样品的来源

实验中使用的精液和精浆样品来自3头成熟、健康的和繁殖性能好的杜洛克公猪，购买自河南精旺种猪有限公司。

采集的猪精液等体积稀释后，在17℃密闭泡沫盒中经24～30h运输至实验室。然后利用SQS检测精液样品密度、质膜完整性和精子畸形率。利用CASA检测精液样品的运动参数。精子活率>70%且质膜完整性>75%的精液样品用于本实验。之后使用精液稀释液将精子浓度调整为25×106·mL-1，并于17℃恒温冰箱中保存。

精浆样品制备：将精液样品离心两次（17℃、2400g、3min），取上清（为精浆和稀释液混合物），在显微镜下观察，确认无精子存在，后于-80℃冰箱保存。

2.1.2主要仪器及试剂

实验所涉及的主要仪器设备有：CASA，SQS，流式细胞仪，离心机，精液专用冰箱（青岛世博），自动生化分析仪，水浴锅，恒温箱。

所使用的精液稀释液为ACROMAXPLUS，精子质量与功能检测染料包括：Hoechst33342（H42）（Sigma），碘化丙啶（PI）（ThermoFisher），异硫氰酸荧光素共轭花生凝集素(FITC-PNA)（Sigma），CM-H2DCFDA（ThermoFisher），MitoTrackerDeepRed（ThermoFisher）。精浆氧化和抗氧化水平检测使用总抗氧化物水平（TAC）试剂盒（碧云天）和总氧化物水平（TOS）试剂盒（碧云天）。

2.2实验步骤

2.2.1CASA系统的检测

CASA系统用来检测猪精子的活率、活力和运动参数。

将准备好的精液样品放入37℃的暖管器中，加热3min左右（此时精子的活率最为活跃）。取出试管，摇晃均匀，每次测定时，吸取5μL精液样品加到预热至38℃的精子计数板上，盖上玻片并置于显微镜下观察。选取4-5个清晰视野，每个样品至少计数300个精子。记录下活率（%）与活力（%），将数据与图像保存下来。一个样品检测好后，滴加PBS缓冲液在计数板上，并用干净的面纸轻轻擦干，进行下一个样品检测。

2.2.2流式细胞术检测

使用流式细胞术（FCM）检测精子质膜和顶体膜完整性，ROS，线粒体膜完整性。

将100μL的每个精液样品（25x106/mL）加入到装有3μLH42（0.05mg/mL），2μLPI（0.5mg/mL）和2μLPNA-FITC（200μg/mL）培养管中。将样品混匀并置在于38℃避光孵育10min。在用流式细胞仪分析之前，每个样品中加入400μLPBS。每个样品记录10000个精子。H42阳性、PI和PNA-FITC阴性，则表示为活精子。

细胞内ROS的产生通过测定细胞内过氧化氢（H2O2）的含量来评估。将50μL每个精液样品（25x106/mL）加入到含有950μLPBS，1.25μLH42（0.05mg/mL），1μLPI（0.5mg/mL）的培养管中和1μLH2DCFDA（在DMSO中为1mM）。在流式细胞仪分析之前，将所有样品置于37℃避光孵育30分钟。每个样品记录10000个精子。H42阳性，PI阴性和DCF阳性，则表示为活细胞，并且细胞内具有较高的H2O2含量。

精子线粒体膜完整性的测定是将100μL精液样品（25x106/mL）加入到装有3μLH42（0.05mg/mL），2μLPI（0.5mg/mL）和5μLMitotrackerDeepRed633（在DMSO中为1mM）流式管中。在用流式细胞仪分析之前，每个样品中加入400μLPBS。每个样品记录10000个精子。H42阳性，PI阴性和MitoTracker阳性则表示为精子线粒体膜完整性，结果记录为活细胞线粒体膜完整。

2.2.3精浆中的总抗氧化水平（TAC）和总氧化水平（TOS）测定

按照碧云天生物技术研究所提供的试剂盒说明书测定精浆中的总抗氧化水平（TAC）和总氧化水平（TOS）。

3结果

1.不同温度和不同保存时间点均对猪精子质量和功能有着显著影响。在不同温度下保存猪精液24h的过程中，精子细胞内ROS水平均呈现先下降后升高的显著变化（P<0.05），活率、活力和质膜完整性的显著降低（P<0.05）仅在37℃下保存的过程中出现，而顶体膜损伤比例的显著升高（P<0.05）仅出现在室温保存的过程中。与在17℃和室温下保存相比，37℃保存6h后即出现质膜完整性的明显下降（P<0.05），而在18h后，精子活率和活力显著下降（P<0.05）。在保存24h后，室温保存比17℃和37℃保存造成更严重（P<0.05）的顶体膜损伤。与在17℃和室温下保存相比，37℃保存6h后引起更多精子细胞内ROS的产生（P<0.05），而保存24h后这种差异不再显著。

2.不同温度（17℃，室温和37℃）下保存猪精液24h后，精浆TOS和TAC水平。a和b指示不同温度组间差异显著，P<0.05。结果显示，精浆TAC水平在不同温度保存下没有明显变化，而精浆TOS水平则随保存温度的升高而呈现显著下降趋势（P<0.05）。

3.模拟夏季猪精液快递运输过程中温度的变化对精子质量和功能的影响。在夏季温度较高的时间段运输猪精液，精子活率和活力受到温度变化的显著影响。从17℃到30℃的升温过程中猪精子活力和活率未受到明显影响，而从30℃到37℃，精子活率和活力均出现显著的急剧下降（P<0.05）。到达后将猪精液重新保存在17℃冰箱，精子活率和活力没有得到恢复。然而，在17℃下恒温运输精子活率和活力在到达时未收到明显影响，且再保存1d后仍能满足人工授精对质量的要求（活率>60%）。对比温度变化和17℃恒温两种条件发现，精液温度在17～30℃之间时，精子活率和活力没有表现出组间差异，但是当温度上升到37℃后，温度变化处理显著（P<0.05）损伤了精子活率和活力，这种损伤无法通过重新降温到17℃下保存来恢复。

高温环境下运输猪精液对精子质量和功能参数有着明显的影响。其中，与17℃时相比精子质膜完整性和线粒体膜潜能随温度升高出现上升趋势（P<0.05），而顶体损伤的比例和细胞内ROS水平下降（P<0.05）。17℃恒温条件下运输猪精液对以上猪精子质量和功能参数有着类似的影响。对比温度变化和17℃恒温两种不同条件对猪精子质量和功能的影响发现，17～20℃条件下运输对精子质量和功能的影响不明显，30℃以上运输显著影响了猪精子质膜和顶体完整性（P<0.05）。

4.运输过程中不同温度（时间点）下精浆TOS和TAC水平

精液运输过程中不同温度（时间点）精浆TOS和TAC的水平。a，b和c指示精浆中TAC水平在不同温度（时间点）间差异显著，P<0.05。

结果表明，夏季高温条件下运输猪精液，精浆中的TOS水平在运输过程中及到达后17℃下保存3d的过程中没有明显的改变，而此过程中精浆TAC水平从精液温度达到30℃后显著上升（P<0.05）并维持，在达到后17℃下再次保存3d后下降到与之前30℃时相似的水平。

4讨论

夏季高温条件下运输猪精液，运输过程中精液温度的变化会造成精子质量和功能的下降，尤其当精液温度超过30℃以后这种损伤更明显。温度变化可能引起精子受到氧化应激的损伤，而精浆中的抗氧化物质可能有利于精子对抗氧化应激，维持其质量和功能。

张健等研究发现，藏公猪精液在17℃和25℃两种不同温度的保存条件下，精子的活率没有明显的差别，但17℃相较于25℃保存的精液中活精子数更多，因此得出结论猪精液最佳的保存温度为17℃，这与本次试验结果在不同温度下保存猪精液24h的过程中，活率、活力和质膜完整性的显著降低（P<0.05）仅在37℃下保存的过程中出现相一致。吴民研究发现，猪的精子活率随着温度的升高而逐渐降低，且各个温度时间点的检测差异变化均极其显著（P<0.01）。当外界温度达到25℃以上时，精子活率会由于温度的升高而下降的越来越明显；达到30℃时精子活率下降迅速且直接降至7级以下。由此得出影响精子活率最重要的因素是温度这一结论。这与本次试验结果从17℃到30℃的升温过程中猪精子活力和活率未受到明显影响，而从30℃到37℃，精子活率和活力均出现显著的急剧下降（P<0.05）相一致。相关研究表明在精液保存过程中，温度的差异打破了精子所处环境的动态平衡，保存期间产生大量的ROS。过量的ROS会造成氧化损伤，尽管精子细胞本身存在其他多种抗氧化酶，但还需通过加入外源抗氧化剂，避免精子在体外保存过程中受到破坏。

随着科技的进步，抗氧化剂在猪精液保存中的应用越来越广泛。侯震坤等研究发现，在精液稀释剂中加入淫羊藿苷代替部分庆大霉素，对于常温保存下的精液活率、活力和顶体完整性均具有一定保护作用，两者联合更能有效达到抑制精液中细菌生长的作用。在高温运输环节中，为了保证猪精液的质量，须注意以下几点：（1）运输前按规定对精液进行稀释和保存；（2）样品用毛巾包裹好，放入车载恒温运输箱或简易保温箱内，也可以放入各种广口保温瓶等；（3）可选择容积大的泡沫箱，放置的冰袋也更大，从而维持温度能力更强；（4）在运输过程中，样品平放于车中避免强烈震动和碰撞；（5）运输时间一般不得超过70h。

参考文献：

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