医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠镇痛作用及中枢神经机制研究

医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠镇痛作用及中枢神经机制研究

吕倩怡

郴州市第一人民医院 疼痛科，湖南 郴州，423000

摘要：目的:探究医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠镇痛作用并对相应的中枢神经机制进行研究。方法:研究对象为成年雄性神经病理性疼痛大鼠，并建立坐骨神经慢性压迫性损伤模型，给予大鼠注射不同剂量医用臭氧，注射的位置在损伤神经周围，然后观察不同剂量的医用臭氧对大鼠机械痛阈值的影响，并对其作用中枢神经的机制进行研究，主要通过免疫组化技术检测大鼠中脑导水管周围灰质外侧区中P2Y1受体的表达情况。结果:神经病理性疼痛大鼠采用医用臭氧进行治疗后的大鼠机械痛阈值明显的增高，并且随着用量的增加，其疼痛缓解的情况也越来越明显，这个过程伴随着大鼠中脑导水管周围灰质外侧区中P2Y1受体表达的增加，并且其疼痛阈值的增加和P2Y1受体表达也呈现正相关。结论: 医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠可以起到很好的镇痛作用，其镇痛机制与大鼠机械痛阈值以及P2Y1受体的表达有密切的关系。

关键词：医用臭氧；神经病理性疼痛大鼠；镇痛作用；中枢神经；P2Y1；

医用臭氧是医学上常用的混合气体，主要由氧气和臭氧气体组成[1]。其中臭氧是一种比较不稳定的气体，具有比氧气还强的氧化性，能够起到消毒、杀菌等功效，常用作强氧化剂，漂白剂、皮毛脱臭剂、空气净化剂，消毒杀菌剂等[2]。臭氧在临床上最早和最成熟的应用是用来治疗结肠炎[3]，并且其后被运用到更稳广泛的治疗中，如脑中风、关节疾病、椎间盘突出症、前列腺炎、阴道炎等方面，其也表现出一定的医学镇痛作用。神经病理性痛( neuropathic pain，NP) 是机体神经系统原发性损害或疾病诱发的神经功能障碍所导致的疼痛，表现为自发痛、痛觉过敏以及感觉异常三个部分，属于难治性疾病的一种[4]。其发病机制至今尚不完全明确，但多种研究表明其发病和多种细胞因子表达失衡可能有一定的关系，中脑导水管周围灰质外侧（lPAG）对于机体疼痛的调节具有重要的作用，其中lPAG中多种神经递质和受体参与了这一过程，其中三磷酸腺苷(ATP）的作用不可忽视，特别是其中对胞外腺嘌呤核苷酸敏感的受体称P2受体，其亚型又可分为P2X（7个亚型）和P2Y(8个亚型），其中P2X3 受体在疼痛调制中的作用研究最为深入，但是其他受体如P2Y1的研究就比较少。其共同参与损害性信息的传递和疼痛的发生发展。本实验分析医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠镇痛作用及中枢神经机制的影响，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

研究对象均是本科研室自己饲养的100只洁净成年的公大鼠，体重在200-220g之间。将所有大鼠按照4只每笼进行分组，并且把笼子放置到安静，湿度以及温度适宜的温室内，其中室内温度保持在（25±0.5）℃，湿度保持在（60±5）%，并且给予人工补光照射，保持12小时昼夜循环交替，并且给予所有大鼠一样的食物进行喂养，给食量以及给水量要充足，做好实验室的卫生，严禁无关人员的进入。

1.2 研究方法

1.2.1动物分组

将所有大鼠按照笼子分为5组，分组随机，分为正常组，假手术组，手术组加低剂量医用臭氧组，手术组加中剂量医用臭氧组，手术组加高剂量医用臭氧组，对除正常组外的大鼠给予假手术以模拟神经病理性疼痛，并给予相应剂量的医用臭氧来注射到损伤的神经周围。

1.2.2模型的制造［5-7］

取成年公大鼠，4% 水合氯醛 20 mL /kg 腹腔注射进行麻醉，使其呈左侧卧位固定在操作台上，对其右肢进行消毒然后切开皮肤，根据其自然的肌束走向来分离肌层，暴露近端坐骨神经约8 mm，然后将其神经主干进行轻度结扎，以结扎3道线为宜，每道线的间距为1.5 mm。但是要注意确保神经膜轻度凹陷而不影响其血液循环，然后逐层缝合肌肉和皮肤。假手术组只做皮肤切开，钝性分离坐骨神经但不结扎。

1.2.3臭氧注射部位及方法

在大鼠股骨大转子和坐骨结节间皮肤进针后向前内侧前进，沿着坐骨神经走行呈扇形注射药液[1]。小鼠手术完成一周后进行药物的注射，注射前1天以及注射之后的1、3、5、7天分别进行机械痛阈值的检测，并于注射后14天进行P2Y1受体表达情况的检测。其中假手术组给予注射一定量的空气。因为现有研究认为浓度为35μg/ml作用最大且不会对小鼠造成危害，故所有使用的臭氧皆为此浓度，其中低剂量组给予注射医用臭氧0.125ml，中剂量组给予注射医用臭氧0.25ml，高剂量组给予注射医用臭氧0.5ml[8]。

1.2.4

首先测定大鼠的机械痛阈值，并对大鼠中脑导水管周围灰质外侧区中P2Y1受体表达情况进行检查，采用免疫组织化学染色进行检查。

1.3观察指标

1.3.1大鼠机械缩足反射阈值的测定

在大鼠处理前1天以及处理后的1、3、5、7天分别进行机械缩足反射阈值的测定，将大鼠放置到特定的容器中，在和饲养室温相同的室温环境下进行，要保持环境安静卫生，采用上下法测定大鼠机械缩足反射阈值( mechanical withdrawal threshold，MWT)。将大鼠置于带有网格的金属垫上，用有机玻璃罩罩住限制其活动，使其适应20 min，然后使用不同刺激强度(g)的 Von Frey 纤维丝刺激大鼠右后爪足底皮肤，Von Frey 纤维弯曲90°维持约5s，观察大鼠有无缩足反射，以大鼠出现明显缩足或舔足行为为阳性反应，记录折力值即为机械缩足反射阈值(g)。观察并记录所有大鼠的机械痛阈值，在大鼠处于安静状态后时候检测，采用电子von Frey 纤维刺激大鼠后肢足底中部2s，出现缩足反应时读数为大鼠的机械痛阈值。

1.3.2 免疫组化检测P2Y1受体阳性细胞

注射后第14天进行P2Y1表达情况的检测。免疫组织化学染色大鼠4%水合氯醛(20 mL/kg)腹腔内注射，深度麻醉后，取出大鼠脑组织置于4%多聚甲醛溶液中，6h后转移至30%蔗糖溶液中直至脑组织沉底。冰冻包埋剂(OCT)包埋后－20℃冰冻切片机中速冻40min，沿大脑冠状位连续切片，厚25μm。每5～6张PAG切片取一张进行免疫组织化学染色分析，每只大鼠取10张。3%H2O2封闭40min，3%正常牛血清封闭1h，加入兔抗大鼠P2Y1(1∶200)，于37℃烤箱中孵育1h后转移到4℃冰箱中过夜。按说明书加入超敏二步法检测试剂，用DAB进行显色，自然风干后梯度酒精脱水，二甲苯透明；中性树胶封片，封固后在光镜下观察并采集图像。在切片放大400倍条件下，用Image-Pro Plus 6．0图像分析软件对lPAG的阳性图片进行阳性细胞计数。lPAG中细胞有细胞核、一个完整的胞体和细胞边界算做一个细胞。计数每一个视野中的细胞数，每张计数5个不重叠的视野，取均值。

1.4 统计学方法

数据用SPSS20.0统计分析，计量资料（x±s）表示，组间比较用t检验，计数资料用例数（n，%）表示，X2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠机械痛阈值变化

医用臭氧对CCI大鼠MWT的影响与假手术组比较，在处理前所有组别的MWT均无统计学意义的差异，P＞0.05，采用不同的方式进行处理后，各手术组大鼠的MWT明显降低。但是在注射医用臭氧后，大鼠的机械痛阈值有所提高，并且在使用范围内的机械痛阈值会逐渐增高，各组之间的机械痛阈值差异均有统计学意义 (P＜0．05）可以明显的观察到大鼠的机械痛阈值提高值与医用臭氧注射量成正相关。见表1。

表1 大鼠机械缩足反射阈值变化（x±s)

2.2 大鼠中脑导水管周围灰质外侧区中P2Y1受体表达情况对比。

注射后第14天观察P2Y1受体的表达情况，可以发现，正常组以及假手术组的大鼠相应部位的P2Y1受体表达均比较低，并且无统计学意义上的差异（P>0.05），但是在使用医用臭氧对假手术的大鼠进行处理后，可以发现明显的P2Y1受体表达增加，并且随着医用臭氧使用量的增加，P2Y1受体表达水平也逐渐增高，差异具有统计学意义，P＜0.05。见表2。

表2 P2Y1 受体阳性细胞对比[3]（x±s)

3讨论

由于神经病理性疼痛在临床上比较常见，其主要的发病原因是由于躯体的感觉系统出现一定的损伤或者遭受了某种疾病的干扰，表现为自发性疼痛、痛觉过敏以及异常痛敏等多种类型。其引发的原因也被比较多样性，常见的原因有机械损伤、免疫因子作用或者由于炎症因子引发的中枢以及外周神经敏化。

医用臭氧是具有刺激性气味的不稳定气体，具有比较广泛的应用范围。特别是近年来，其被应用于临床治疗方面来缓解疼痛，并且取得了较好的临床效果。经研究表明给CCI大鼠注射一定量的臭氧化生理盐水可明显的延长大鼠患足MWT。其镇痛机制可能与促进中枢中脑导水管周围灰质外侧区(lPAG)中嘌呤核苷酸P2受体的表达和功能活化有关，但也有学者认为其镇痛的机制与其活化AMP依赖的蛋白激酶AMPK有关。但关于其镇痛的机制尚需进一步研究。但是根据临床应用可以推测其作用的机制可能是臭氧作用于机体后会阻止促炎症因子的释放，从而减少机体的疼痛感，特别是在直接注射后，臭氧可以直接作用于外周神经末梢，促进脑腓肽等物质释放，这些物质对于机体镇痛有着积极的作用[7]。也有研究表明，臭氧注射到机体后由于其过度的氧化能力可能会极大地刺激机体中的抗氧化酶的过度释放，这个过程可能会清除氧自由基从而起到一定程度的镇痛作用。中脑导水管周围灰质是动物机体内维持镇痛的重要部位。

三磷酸腺苷(ATP)是机体储能和供能的重要物质，但是其也是一种重要的神经递质。ATP受体中对胞外腺苷敏感的受体称P1受体，属G蛋白偶联受体家族，包括A1、A2A、A2B、A3 四类，对胞外腺嘌呤核苷酸敏感的受体称P2 受体，其亚型又可分为P2X 和P2Y等多个类型，其中P2X3受体的表达对于机体内的痛调制是最为明显有效的，也是研究最多的，但是对于P2Y1受体对疼痛控制的关系鲜有研究。因此为了研究臭氧对中枢神经的镇痛机制，为了确定医用臭氧的镇痛作用是否和P2Y1受体的表达有关系，本研究对不同组别大鼠体内的P2Y1受体表达情况进行了验证。

本研究通过对不同处理组的大鼠机械痛阈值变化情况进行研究证明，对大鼠进行手术处理后[4]，其机械痛阈值明显的比正常组低；但是在注射不同剂量的医用臭氧后，大鼠的机械痛阈值均有不同程度增高，其增高程度和医用臭氧的用量呈现正相关，各组之间的机械痛阈值差异均有统计学意义( P ＜0．05) 。观察大鼠体内的P2Y1受体表达情况可以发现，正常组以及假手术组的大鼠相应部位的P2Y1受体表达均比较低，并且无统计学意义上的差异（P>0.05），这是因为正常组大鼠无疼痛，不需要释放大量的P2Y1受体，假手术后其值只是稍微增加，但是在使用医用臭氧对假手术的大鼠进行处理后，可以发现P2Y1受体表达出现明显的增加，并且对着医用臭氧使用量的增加，P2Y1受体表达的表达呈现出正相关。这说明医用臭氧的注入对于P2Y1受体表达有积极意义。

综上所述， 医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠可以起到明显的镇痛作用，其镇痛机制与P2Y1受体表达程度有密切的关系。调节这些P2受体可以调控外周神经损伤诱发的神经病理性疼痛，应用多种嘌呤受体拮抗剂可以不同程度地缓解痛觉超敏和异常性疼痛，因此，P2受体可以成为治疗神经病理性疼痛的一个重要靶点，也为临床镇痛药物的开发提供了新的思路。但是，目前为止，这些P2受体参与神经病理性疼痛的机制尚不十分明确，有待进一步研究探讨。

参考文献

[1]马旭保，上官军发，孙建民. 医用臭氧通过下调神经病理性痛大鼠核因子κB/核因子κB抑制蛋白α/核因子κB抑制蛋白激酶β的表达发挥镇痛效应[J]. 解剖学报, 2017, 48(5):532-537.

[2]谭珊珊, 李春伟, 王晨晨,等. 加波沙朵对神经病理性痛大鼠的镇痛作用及对脊髓胶质细胞活化的影响[J]. 国际麻醉学与复苏杂志, 2017, 38(10):881-885.

[3]江茜, 王英, 黄诚. 臭牡丹通过促炎细胞因子和NF-κB缓解大鼠神经病理性疼痛[J]. 中国疼痛医学杂志, 2018, 24(5):336-342.

[4]李岩，冯晨，宁美等.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂EMA401作用于神经病理性疼痛模型大鼠的行为学评估及镇痛效应机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12):1909-1914.

[5]肖智, 李尤艳, 孙梦婕. 医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及初步机制探讨[J]. 川北医学院学报, 2015(3):300-305.

[6]Ru JT， Cao J， Wang ZhQ， et al． Establishment of rat chronic neuropathic pain model ［J］ ． Journal of Zhengzhou University ( Medical Sciences) ， 2010， 45( 5) : 773-775． ( in Chinese)茹靖涛， 曹靖， 王振全， 等． 大鼠慢性神经病理性疼痛模型的建立［J］ ． 郑州大学学报( 医学版) ， 2010， 45( 5) : 773-775．

[7] 肖智, 李尤艳, 孙梦婕. 医用臭氧对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及初步机制探讨[J]. 川北医学院学报, 2015(3):300-305.

[8]Bennett GJ， Xie YK． A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man ［J］ ．Pain， 1988， 33( 1) : 87-107

[1]［4］此处需要引用，是不是这篇，你斟酌下，然后增加臭氧量的选择35的浓度的理由，还用量0.125,0.25,0.5ml选择，臭氧是什么时间注射？？术后1/3/5/7天？还是统一注射后，1/3/5/7天后测试？需要在部位方法中综合表达出来，才不会理解错误。

［4］刘永峰， 杨承祥． 坐骨神经周围注射可乐定对 CCI 大鼠促炎性细胞因子表达的影响［J］ ． 包头医学院学报， 2009， 25( 5) : 19 －22

[2]（g这个单位是？中文是？

经查阅文献：机械痛阈值单位为克，g）

[3]（n=?? x±s标本量是多少？数值的单位是？应该表头注明或者表尾标注，有无统计学意义

注：因测定P2Y1需处死小鼠，无法测定1、3、5、7天的数据，仅能检测第14天一次，故表格无法修改，相关内容已与前文做出调整。）

[4]（语句不顺）