花生根瘤菌剂保藏效果及田间接种效应研究

花生根瘤菌剂保藏效果及田间接种效应研究

叶华姬1，吴惠建2，黄红保3

（1. 连平县农作物病虫害预测预报站，广东 河源  517100；2. 连平县农产品检验检测中心，广东 河源  517100；3. 阳江市农作物技术推广站， 广东 阳江 529500)

摘要：探究不同保护剂对花生根瘤菌剂在保藏过程中活菌数的影响及液体菌剂在田间不同施氮水平条件下的应用效果，为花生根瘤菌剂的生产及田间推广提供理论依据。结果表明，以1%PEG4000为保护剂的花生根瘤菌剂保藏效果最好，常温条件下保藏6个月时活菌数为6.76×108 CFU/mL，4℃条件下保藏12个月时活菌数为1.41×109 CFU/mL。田间接种该根瘤菌剂提高了花生各生育期的根瘤数量和根瘤鲜重，且常规施氮配施根瘤菌剂、减半施氮配施根瘤菌剂处理的花生单产相较于常规施氮处理分别提高了12.83%和6.53%，起到了减肥增产的效果。

关键词：花生；根瘤菌剂；生物固氮

中图分类号：S565.2        文献标识码：A

氮素是植物生长发育必需的大量营养元素，通常也是作物产量的限制因素之一[1]。自然界中的氮绝大部分以单质分子氮气（N2）存在于大气中，不能被植物直接吸收利用，因此农业生产高度依赖化学氮肥[2]。但是氮肥的生产需要消耗大量化石能源，并且过度施用氮肥会造成土壤板结退化、温室气体排放和水体富营养化，影响农业的可持续发展[3]。全球对增加粮食产量和同时减少农业化学氮肥投入的需求，加强了豆类作物种植的必要性。豆科植物与根瘤菌可以相互作用形成一个独特的器官，即根瘤。根瘤中的共生固氮是自然界中氮气还原为可被植物吸收利用的氨的重要途径[4]。因此，田间施用根瘤菌剂对提高豆科植物的共生固氮能力、减少对化学氮肥的依赖、发展绿色可持续农业和实现“双碳”战略具有重要意义。

豆科植物-根瘤菌共生固氮每年的固氮量约为21.5 Tg，占陆地生态系统固氮总量的60%左右，是对全球生物固氮总量贡献最大的体系[5-7]。与工业固氮的高温高压条件相比，共生固氮在常温常压下就可以进行，因此豆类作物接种根瘤菌剂是一种经济有效且无污染的农业实践手段[8]。花生（Arachis hypogaea L.）是世界上主要的油料和粮食作物之一，也是油脂、蛋白质、微量元素（矿物质、抗氧化剂和维生素）和次级代谢产物（类黄酮、叶酸、生育酚和白藜芦醇）的重要来源[9]。花生通过生物固氮可以满足自身氮素需求的60%~65%，在间作或轮作过程中能够保持土壤健康和肥沃[10]。应用携带高效根瘤菌的根瘤菌接种剂可以增加结瘤数量，提高共生固氮效率，从而促进花生的营养生长和生殖生长[11]。几十年来，花生根瘤菌剂的生产一直选用草炭作为载体吸附菌液制作固体菌剂[12]。草炭含有土壤缺少的腐殖质并具有良好的颗粒结构和较高的持水量，但是许多地区由于草炭资源不足而采用煤炭、植物堆肥或蛭石等材料作为替代载体[13]。研究表明，从增产效果来看，液体菌剂与固体（草炭）菌剂差异不大，可以代替费工费时的草炭菌剂[14]。此外，大多数固体菌剂的平均保质期为180 d，而以聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和海藻酸钠等作为保护剂的液体菌剂的保质期可延长至两年[15]。

尽管花生接种根瘤菌剂的历史悠久，但制作菌剂需要具备高效竞争结瘤和共生固氮能力的花生根瘤菌，并且在保藏和田间应用过程中需保持较高的活菌数，因此只有少部分花生根瘤菌剂应于农业生产。本研究选用两种保护剂制备花生根瘤菌液体菌剂，探究其在不同温度条件下的保藏效果以及在不同施氮水平下的接种效应，旨在为液体根瘤菌剂的保藏和推广应用于花生大田栽培提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

TY培养基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，二水氯化钙0.832 g/L。供试花生品种为粤油43，供试菌种为与广东省主栽花生品种匹配性较好的根瘤菌Y1（Bradyrhizobium），均由广东省农业科学院作物研究所提供。聚乙二醇购自北京索莱宝科技有限公司，海藻酸钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。阿拉伯胶粉作为拌种粘合剂，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。田间试验于2021年在广东省农业科学院白云试验基地（23° 23' N、113° 26' E）进行。试验地土质为砂壤土，土壤pH 6.39，有机质、全氮、全磷、全钾含量分别为12.90、0.62、0.74、6.64 g/kg，碱解氮、有效磷、速效钾、有效钙、有效镁含量分别为57.50、62.12、88.00、627.00、101.80 mg/kg。

1.2试验方法

1.2.1  液体菌剂的制备与检测

将花生根瘤菌GDHS-5接种到5 mL TY液体培养基中，置于28 ℃振荡培养。达到对数期后按照1%的接种量转接到250 mL TY培养基中，28 ℃振荡培养至对数期后期。向菌悬液中添加保护剂，使PEG4000的终浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，海藻酸钠的终浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%和0.4%，添加与保护剂等量的无菌水作为对照（CK）。每个处理分别置于室温和4 ℃条件下保存，每隔15 d取样并采用稀释平板测数法检测根瘤菌剂的活菌数。

1.2.2  田间试验设计

设置6个处理，常规施氮（处理A）、减半施氮（处理B）、不施氮肥（处理C）、常规施氮配施根瘤菌剂（处理D）、减半施氮配施根瘤菌剂（处理E）、不施氮肥配施根瘤菌剂（处理F）。各处理施磷肥（P2O5）90 kg/hm2，钾肥（K2O）120 kg/hm2。常规施氮为施尿素（含氮量≥46.4%）120 kg/hm2，减半施氮即施尿素60 kg/hm2。根瘤菌剂按照106个活菌数/粒种子的田间接种量标准进行花生拌种，在阴凉通风处将种子荫干后播种。每个处理3次重复，随机区组设计。每个小区长15.00 m，宽1.20 m，种植规格为20 cm × 25 cm。试验期间大田按照当地花生田间日常管理执行。分别在花针期、结荚期、成熟期取样，每个小区随机取5株测定主茎高、地上部分鲜重、根瘤数量、根瘤鲜重。收获后测定单株荚果数、百果重、百粒重和单产。

1.3数据分析

使用Microsoft Excel 2019对表型数据进行统计和整理，采用SPSS 25.0对数据进行显著性分析，采用GraphPad prism 9.0.0绘图。

2  结果与分析

2.1常温条件下菌剂质量检测

由图1可知，根瘤菌剂的初始活菌数在3.4×109 CFU/mL左右，随着保藏时间的延长活菌数持续下降。添加不同浓度的PEG4000或海藻酸钠作为保护剂均提高了根瘤菌在常温条件下的存活率，其中1.0% PEG4000的保护性能最强，其次为0.3%海藻酸钠。第6个月时，CK、Y1+1.0% PEG4000和Y1+0.3%海藻酸钠3个处理的活菌数分别为1.00×106 CFU/mL、6.76×108 CFU/mL和4.17×108 CFU/mL，存活率分别为0.03%、19.98%和12.31%。与CK相比，添加1.0% PEG4000和0.3%海藻酸钠分别使根瘤菌的存活率提高了19.95%和12.28%。

图1常温条件下根瘤菌剂的活菌数变化

Figure 1  Dynamic changes in viable cell counts of rhizobiuminoculantsat room temperature

2.2  4℃条件下菌剂质量检测

如图2所示，4℃条件下保藏减缓了根瘤菌剂活菌数下降的速率，且添加保护剂进一步延长了保藏期限。与常温保藏结果一致，根瘤菌剂在4℃保藏期间添加1.0% PEG4000后活菌数最高，其次为0.3%海藻酸钠。在第12个月时，CK、Y1+1.0% PEG4000和Y1+0.3%海藻酸钠3个处理的活菌数分别为6.02×102 CFU/mL、1.41×109 CFU/mL和1.10×109 CFU/mL，存活率分别为0.002%、39.72%和32.45%。综上可知，以1% PEG4000作为保护剂时保藏效果最好，因此选择1% PEG4000作为保护剂制备液体菌剂用于田间试验。

图24℃条件下根瘤菌剂的活菌数变化

Figure 2Dynamic changes in viable cell counts of rhizobiuminoculants under 4℃ conditions

2.3不同处理对花生共生结瘤性状的影响

不同生育期的共生结瘤表型结果（表1）显示，施用花生根瘤菌剂提高了花生的株高和鲜重，但处理间不具有显著性差异。与处理A相比，处理D在花针期、结荚期和成熟期的根瘤数量分别提高了28.35%、18.71%和33.40%，根瘤鲜重分别提高了150.00%、66.67%、19.66%。与处理B相比，处理E在花针期、结荚期和成熟期的根瘤数量分别提高了24.58%、20.94%和34.25%，根瘤鲜重分别提高了38.89%、8.38%、20.25%。与处理C相比，处理F在花针期、结荚期和成熟期的根瘤数量分别提高了28.72%、28.29%和26.41%，根瘤鲜重分别提高了90.91%、60.33%、6.74%。可以看出，在氮肥水平相同时施用花生根瘤菌剂不仅提高了不同生育期花生的根瘤数量和根瘤鲜重，同时促进了花生的营养生长。

2.4不同处理对花生经济性状和产量的影响

收获后，小区产量及相关经济性状统计结果见表2。与处理A相比，处理D的单株荚果数、百果重、百仁重和单产分别显著增加了25.69%、6.89%、11.72%和12.83%。与处理B相比，处理E的单株荚果数、百果重和单产分别显著增加了26.04%、6.46%和14.23%。处理F的经济性状和产量表现虽优于处理C，但两处理间不具有显著性差异。上述结果表明，在施氮量相同的条件下，配施花生根瘤菌剂明显改善了花生的经济性状，具有较好的增产效果。

表1不同处理对花生经济性状和产量的影响

注：处理A、B、C、D、E、F分别代表常规施氮、减半施氮、不施氮肥、常规施氮配施根瘤菌剂、减半施氮配施根瘤菌剂、不施氮肥配施根瘤菌剂。同列不同小写字母表示处理间差异显著（P < 0.05）。

3结论与讨论

土著根瘤菌在有豆科植物种植史的田间含量丰富，因其竞争结瘤性较强而共生固氮能力较弱，接种的根瘤菌通常无法与其在竞争结瘤中取得优势。当根瘤菌剂基于具有高效固氮能力的土著根瘤菌时，由于其对当地土壤环境的遗传适应性，通常在田间表现优异[17]，即根瘤菌剂具有较强的地域限制性。花生根瘤菌Y1分离自广东花生产区，与广东主栽花生品种匹配性较好。因此，本研究以Y1为出发菌株制备液体菌剂。菌剂质量检测结果表明，添加1% PEG4000后保藏效果最好，0.3%海藻酸钠次之，常温条件下保藏6个月时活菌数均保持在108CFU/mL以上，4℃条件下保藏12个月时活菌数均保持在109CFU/mL以上。虽然低温条件增加了保藏成本，但根瘤菌剂的保藏期限提高了1倍以上。

土壤中氮素含量（硝态氮为主）过高或过低均会抑制根瘤形成和发育。Xia等[18]研究发现大豆的根瘤数量随氮素浓度的升高先增加后减少，氮素浓度高于50 mg/L时可显著抑制结瘤。吴月等[19]研究表明2.5 mmol/棵KNO3能够显著抑制花生结瘤，5 mmol/棵KNO3几乎完全抑制结瘤。本研究发现各生育期花生在减半施氮条件下的根瘤数量最多，在常规施氮条件下最少，表明花生前期需要一定量的氮素启动结瘤，而过量施氮则对结瘤过程产生了抑制效应，这与前人研究结果一致。王永长等[20]研究表明，与常规施氮相比，常规施氮配施固体根瘤菌剂、减半施氮配施液体根瘤菌剂分别使花生产量增加了7.00%和5.02%。本研究中，常规施氮配施根瘤菌剂、减半施氮配施根瘤菌剂处理的花生单产相较于常规施氮分别提高了12.83%和6.53%，同样起到了减肥增产的效果，表明此根瘤菌剂在广东省各花生产区具有较大的应用前景。

参考文献（References）：

[1]郭佩，王佳艺，史晓龙，任婧瑶，陈冲，张萍，熊焕烨，张鹤，赵新华，王晓光，于海秋，蒋春姬. 施氮量对不同基因型花生结瘤特性及氮素利用的影响[J].沈阳农业大学学报, 2022, 53(04):385-393.

[2]Yang J, Lan L, Jin Y, Yu N, Wang D, Wang E. Mechanisms underlying legume-rhizobium symbioses. Journal of Integrative Plant Biology, 2022, 64(2):244-267.

[3]Ke X, Xiao H, Peng Y, Wang J, Lv Q, Wang X. Phosphoenolpyruvate reallocation links nitrogen fixation rates to root nodule energy state. Science, 2022, 378(6623):971-977.

[4]董汝，曹扬荣. 豆科植物-根瘤菌共生固氮的免疫调控机制[J].生物技术通报, 2019, 35(10):25-33.

[5]李敏，梁伟健，付时丰，罗培宇，杨劲峰，韩晓日. 花生缓释专用肥配施根瘤菌菌剂的肥效和增产增效作用研究[J]. 花生学报, 2022, 51(02):32-38.

[6]张红艳，张长生，燕炳辰. 连作花生应用根瘤菌剂的效果研究[J]. 辽宁农业科学, 2014, (02):68-69.

作者简介：叶华姬（1985—），女，汉族，大学本科，助理农艺师，研究方向为农作物新品种选育及推广，E-mail：116982571@qq.com

通信作者：黄红保（1968—），男，汉族，大专，高级农艺师，研究方向为农作物新品种选育及推广，E-mail：805742130@qq.com