猪肉中磺胺二甲嘧啶残留量测定的测量不确定度评定

猪肉中磺胺二甲嘧啶残留量测定的测量不确定度评定

张伟贤

(广东省食品检验所, 广州  510410)

摘 要：目的 对采用液相色谱-质谱/质谱法测定猪肉中磺胺二甲氧嘧啶残留量的不确定度进行评定。结果 本次评定不确定度主要来源于标准溶液配制引入的不确定度、样品称量引入的不确定度、样品测定重复性引入的不确定度、样品定容引入的不确定度、标准曲线拟合引入的不确定度以及回收率引入的不确定度。当猪肉中磺胺二甲嘧啶含量为450.36 μg/kg时，其扩展不确定度为31 μg/kg（k=2） 。结论 试验的不确定度主要由测量重复性、标准溶液的配制和标准曲线拟合引入。

关键词：猪肉；磺胺二甲氧嘧啶；不确定度

1 引言

磺胺类药物廉价且高效,主要用于生猪的疾病防治，甚至作为饲料添加剂用来促生长或增产[1-2],但过量使用会在猪肉中残留。研究显示,磺胺类药物代谢时间长且有蓄积,长期摄入含有此类药物的食品,会引起过敏反应以及引发泌尿系统、肝脏损伤[3];一些磺胺类药物还会影响造血功能,从而引发癌症4]。

测量不确定度是“根据所用到的信息,表征赋予被测量值分散性的非负参数”[5],是评价实验室检测结果质量优劣或可信程度的定量指标间。目前,分析测定猪肉中磺胺二甲氧嘧啶残留量的不确定度影响因素的报道较少。试验拟采用乙腈一水(Vzm:V*=100:3)溶液涡旋振荡提取,经乙腈饱和正己烷萃取,旋转蒸发、氮吹浓缩前处理后，应用液相色谱一质谱/质谱法技术对猪肉中的磺胺二甲氧嘧啶残留量进行测定，并依据CNAS-GL006《化学分析不确定度的评估指南》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》,分析试验过程中可能引入的各不确定度分量,对猪肉中4种磺胺类药物的检测结果进行不确定度评估，旨在为猪肉品质评价提供依据。

2  材料与方法

2.1 仪器与设备

高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（SCIEX， TRIPLE QUAD 4500）、电子天平（梅特勒，PL602E、可调移液器（Eppendorf，0 μL-10 μL；Eppendorf，10 μL-100 μL；Eppendorf，100 μL-1000 μL；Eppendorf，1 mL-5 mL）、容量瓶（天波，10 mL）。

 2.2试剂与材料

标准物质：甲醇中24种磺胺类药物混标溶液（磺胺二甲嘧啶浓度为100.2 μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司）。

试剂：乙腈（HPLC，默克化工技术（上海）有限公司）、甲酸（HPLC，广州硕谱生物科技有限公司）、正己烷（HPLC，广州市广联津化工有限公司）、正丙醇（AR，广东广试试剂科技有限公司）、去离子水、乙腈（LC-MS，默克化工技术（上海）有限公司）、无水硫酸钠（AR,广东广试试剂科技有限公司）、C18填料（40 μm，广东联方生物科技有限公司）。

2.3实验方法

2.3.1 原理

检验标准为GB/T 21316-2007《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》，分析方法的原理为：试样中加入C18填料后研磨均匀，其中磺胺类药物残留用乙腈-水在微波辐照辅助下进行提取，用乙腈饱和正己烷溶液分配净化，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量。

2.3.2溶液的配制

取标准储备溶液100 μL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释到刻度，得到质量浓度为1 mg/L的标准物质中间液A。 用10 μL-100 μL移液器取50、100 μL中间液A和用100 μL-1000 μL移液器分别取200、400、600、800 μL中间液A，于6个干净的10 mL容量瓶进中，用50%乙腈水溶液定容至10 mLL，最终得到磺胺二甲嘧啶质量浓度分别为5.01、10.02、20.04、40.08、60.12、80.16 μg/L的系列浓度标准曲线。

2.3.23 样品前处理和测定

称取适量（精确至0.001 g）试样置于研钵中，再称取约6 g（精确至0.01 g）C18填料（若试样为牛奶则需另加6 g硅藻土）加至试样上用玻璃杵轻轻研磨，使样品与填料混合均匀，装入离心管中，加入25 mL 乙腈-水溶液（1000+30），涡旋振荡，放入家用微波炉中光波模式下微波辐射30 s，离心，将乙腈层转入棕色分液漏斗中。离心后的沉淀物再加入2 5mL乙腈摇匀，微波辅助提取30 s，离心，合并乙腈提取液，待净化。提取液中加入25 mL乙腈饱和正己烷溶液，振摇，将底层乙腈溶液移入棕色鸡心瓶中，加入10 mL正丙醇，45℃水浴下旋转蒸发至近干，氮气流吹干。准确加入适量50%乙腈水溶液，超声，溶解残渣，将溶解液转移至离心管中，加入适量乙腈饱和正己烷，涡旋振荡，离心，弃去正己烷溶液，取底层溶液过0.22 μm滤膜，上机测定。根据样品的实际浓度进行二次稀释。

2.3.4 试样测定

色谱条件：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（2.1×100 mm，1.7 μm)；流速：0.35 mL/min；流动相：0.1%甲酸水溶液A：乙腈溶液B；梯度洗脱程序：5%B（0.0 min）-5%B（1.00 min）-30%B（13.00 min）-95%B（14.00 min）-95%B（16.00 min）-5%B（16.10 min）-5%B（18.00 min）；柱温：40℃；进样量：2 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测 (MRM)；其他参数见附谱图。

3  结果与分析

3.1数学模型

猪肉中磺胺二甲嘧啶残留量计算结果为：

其中：

X—试样中磺胺二甲嘧啶残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C—从标准工作曲线上得到的磺胺二甲嘧啶浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V—试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m—样品称样量，单位为克（g）。

3.2  不确定度来源分析

依据测定过程和数学模型分析，测定猪肉中磺胺二甲嘧啶残留量的不确定度分量来源见图1。具体引入的主要不确定度来源包括：标准溶液配制引入的不确定度、样品称量引入的不确定度、样品测定重复性引入的不确定度、样品定容引入的不确定度、标准曲线拟合引入的不确定度以及回收率引入的不确定度等环节。

图1磺胺二甲嘧啶测定不确定度来源图

6.  不确定度分量的评定

6.1  标准溶液配制引入的不确定度urel(C)

6.1.1  标准物质引入的不确定度urel(S)

磺胺二甲嘧啶标准物质的纯度p为99.9%，证书未提供扩展不确定度，相对不确定度为urel(p)=0。

6.1.2  标准物质稀释定容过程引入的不确定度urel(D)

标准物质稀释定容过程引入的不确定度主要来源于10 mL容量瓶、0 μL-10 μL可调移液器10 μL-100 μL可调移液器和100 μL-1000 μL可调移液器的容量允差以及环境温度引起的体积变化。

(1) 容量瓶允差引入的不确定度urel(D1)

查检定证书可得，10 mL容量瓶的不确定度U=0.010mL（k=2），则10mL容量瓶允差的相对标准不确定度为0.010 mL÷2÷10 mL=0.0005。容量瓶允差引入的合成相对标准不确定度。

（2）移液器容量允差引入的不确定度urel(D2)

由“3.1标准溶液配制”可知，标准溶液稀释定容过程中使用到10 μL-100 μL可调移液器分别移取50 μL、100 μL和100 μL-1000 μL可调移液器分别移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL的体积。

查检定证书可得，可调移液器的容量测量结果不确定度见表1，则10 μL-100 μL可调移液器移取移取50 μL的容量允差相对标准不确定度为0.010÷2=0.005，10 μL-100 μL可调移液器移取移取100 μL的容量允差相对标准不确定度为0.008÷2=0.004，则100 μL-1000 μL可调移液器移取200 μL的容量允差相对标准不确定度为0.010÷2=0.005，则100 μL-1000 μL可调移液器移取400 μL的容量允差相对标准不确定度为0.010÷2=0.005，则100 μL-1000 μL可调移液器移取600 μL的容量允差相对标准不确定度为0.010÷2=0.005，则100 μL-1000 μL可调移液器移取800 μL的容量允差相对标准不确定度为0.010÷2=0.005。移液器引入的合成相对标准不确定度。

表1. 可调移液器容量测量结果不确定度

（3）温度变化引入的不确定度urel(T)

容量瓶和移液器已在20℃条件下校准，而实验室温度变化在(20±5) ℃以内。该影响引起的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数来进行计算。液体的体积膨胀明显大于容量瓶和移液器的体积膨胀，因此只需考虑前者即可。由“3.1标准溶液配制”可知，本实验涉及的液体包括水和乙腈，乙腈的体积膨胀系数为0.00137℃-1，而水的体积膨胀系数为0.00180℃-1，此处只考虑水的体积膨胀影响。环境温度变化的相对标准不确定度urel(T)= 5℃×0.00180℃-1÷=0.0052。

由以上不确定度分量可得，标准物质稀释定容过程引入的不确定度

由以上不确定度分量可得，标准溶液配制引入的不确定度。

6.2  样品称量引入的不确定度urel(m)

根据样品称量过程中所使用分析天平的计量检定证书，其扩展不确定U=0.002 g (k=2)，则标准物质称量的不确定度为u(m)=U÷k=0.002 g÷2=0.001 g，样品称样量为2.000 g，则称量引入的相对标准不确定度urel(m)=0.001 g÷2.000 g=0.0005。

6.3  样品测定重复性引入的不确定度urel(test)

由重复测定引入的不确定度属于A类评定。本实验对样品进行6次重复测定，结果见表2。根据试剂空白测定结果C0=0，试剂空白引入的不确定度可忽略不计。

表2 猪肉中磺胺二甲嘧啶含量的重复测定结果

根据表2的重复测量结果，可得标准偏差为：，则样品测定重复性引入的相对标准不确定度为。

6.4  样品定容引入的不确定度urel(V)

样品溶液定容引入的不确定度主要来源于移液器的容量允差和环境温度引起的体积变化。样品溶液定容采用100 μL-1000 μL可调移液器移取1 mL，用10 μL-100 μL可调移液器移取25 μL样品溶液于进样瓶中，使用100 μL-1000 μL可调移液器移取975 μL的体积进行样品溶液稀释。参考“6.1.2”，100 μL-1000 μL可调移液器移取1000 μL的容量允差相对标准不确定度为0.001÷2=0.0005，10 μL-100 μL可调移液器移取25 μL的容量允差相对标准不确定度为0.002÷2=0.001，100 μL-1000 μL可调移液器移取1000 μL的容量允差相对标准不确定度为0.001÷2=0.0005。环境温度变化的相对标准不确定度urel(T)= 5 ℃×0.00180 ℃-1÷=0.0052，则样品溶液定容引入的相对标准不确定度为。

6.5 标准曲线拟合引入的不确定度urel(curve)

采用内标法对6个不同浓度的标准系列溶液进行测定，得到相应的磺胺二甲嘧啶的峰面积，见表3，以最小二乘法拟合，得到浓度x和峰面积y的线性方程和相关系数。回归方程为y =bx+a，其中b=11300.92058；a=3864.93475，相关系数(r)为0.99577。

表3 磺胺二甲嘧啶标准曲线测定结果

根据贝塞尔公式计算标准曲线的残差的标准偏差S为：

本实验对样品进行了6次测定，样品溶液中磺胺二甲嘧啶平均含量为22.669 μg/L(表2)，根据贝塞尔方程计算本次实验的标准曲线不确定度S(c)为：

式中，P为样品重复测定次数(P=6)； N为标准系列的总测定次数(n=7)；为样品用该拟合曲线测定6次的浓度平均值(22.669 μg/L)；为标准系列溶液的平均浓度(35.905 μg/L)；xi为标准曲线各点的浓度；b为拟合曲线的斜率。

则标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(curve)为：

6.6  回收率引入的不确定度urel(R)

在样品中加入80 μL磺胺二甲嘧啶质量浓度为10 mg/L的标准溶液，与样品同法处理，测量结果见表4。

表4  样品加标回收率的结果及标准偏差

回收率标准不确定度为：

则回收率引入的相对标准不确定度为：

用检测统计数据t对平均回收率进行显著性检验，在95%置信概率，自由度n=1时的t分布临界值t0.95(2) = 12.71，即当检验值 t ≥ 12.71 时，则与回收率 100% 有显著性差异，须使用回收率修正结果；反之则无需采用回收率修正结果。

t0.95(2)，与回收率100%之间无显著性差异，无需采用回收率修正结果。

7 合成不确定度

综合上述对各不确定度分量及其相对标准不确定度，汇总统计结果见表5。

表5 各分量的相对标准不确定度分量表

根据表5各分量的相对标准不确定度，合成相对标准不确定度为。样品中磺胺二甲嘧啶含量为450.36 μg/kg，则合成标准不确定度为u(X)=450.36×0.0336=15.13 μg/kg。

8 测量不确定度报告

在95%置信概率下取包含因子k =2，则测量结果的扩展不确定度为U= u(X) ×k=15.13×2=30.26 μg/kg，故测定猪肉中磺胺二甲嘧啶残留量的扩展不确定U=31 μg/kg（k=2）。