载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨对兔骨缺损修复组织中碱性磷酸酶的影响

载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨对兔骨缺损修复组织中碱性磷酸酶的影响

涂建龙1 董章庆2 吴维3

南昌市洪都中医院  创伤二科     江西省南昌市   330000

【摘要】  目的 探讨载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨修复骨缺损对碱性磷酸酶活性的影响。方法 36只成年新西兰兔制作胫骨缺损模型，随机分为复合组、单纯组与对照组，每组12只。复合组植入载rhBMP-2活性肽/rhCXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，单纯组植入单纯梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，对照组不植入任何材料。观察三组手术效果，比较三组术后30天、60天、90天测定实验兔骨缺损修复组织中碱性磷酸酶(ALP）活性检测结果。结果 三组均未发生全身异常反应。伤口无感染，愈合良好，缝线自行脱落。术后30天三组碱性磷酸酶较术前显著增高，术后60天达最高峰，术后90天又下降。术后30天、60天、90天复合组碱性磷酸酶活性检查结果高于单纯组和对照组，且单纯组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨可提高骨缺损修复组织中碱性磷酸酶活性，有效促进骨缺损修复。为后续临床试验和应用提供了有效证据。

【关键词】   载BMP-2活性肽/CXCLl2；中空羟基磷灰石；3D生物打印；仿生骨；碱性磷酸酶；骨缺损

大段骨缺损修复是一难题，利用种子细胞成骨修复已得到公认，但外源细胞植入后低成活，且目前人工骨结构与天然骨有较大差距，更影响了种子细胞的归巢、成活、成骨分化。获取内源性间充质干细胞（M SCs）促进骨再生，优化MSCs增值、归巢、生存并成骨分化的骨生长支架、微环境是解决大段骨缺损修复研究的重要方向。本课题组前期成功制备了载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，预实验表明该材料能募集并促进MSC s增值、生存，证实了其在体外具有缓释行为。作者拟建立新西兰兔骨缺损模型，观察植入载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨后在骨折愈合过程中对碱性磷酸酶的影响，为其应用于临床骨缺损修复提供理论依据。

1      材料与方法

1.1 材料来源  选取36只成年新西兰兔制作桡骨缺损模型，雌雄不拘(昆明医科大学实验动物中心)，体重2.8~3.0kg。随机分为复合组、单纯组与对照组，每组12只。新西兰兔喂养在室温20℃、相对湿度50%~70%的环境中，自由饮水、进食。

1.2 实验材料及主要试剂 本课题组前期制备了采用3D生物打印技术[1]，用羟基磷灰石／壳聚糖作为材料，打印出梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，同步将具有良好控缓释特性的BMP2活性肽和CXCL12纳米囊，按需打印到支架的指定区域，灭菌处理后备用。碱性磷酸酶体外临床试剂盒购自北京中生生物工程高技术公司。

1.3方法

1.3.1 制备骨缺损动物模型  绑定实验动物。用盐酸氯胺酮注射液(20mg/kg)由耳缘静脉注入麻醉。常规前臂脱毛、消毒、手术铺巾。于前臂中段作2cm纵形切口,暴露桡骨干,在距桡骨近端2.5cm处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨，以同样的方法于第一截骨线远侧 1.5cm 处再次锯断桡骨，造成 1.5cm 的骨缺损模型（含骨膜），复合组将载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨植入缺损处；单纯组植入单纯梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨；对照组不植入任何材料。创面用生理盐水冲洗，逐层缝合后包扎。不作局部内、外固定，伤口不拆线，让缝线自行脱落。术后每天80万单位青霉素肌注，抗炎3天。术后观察兔的饮食、活动、伤口反应,取材后观察植入材料的表面情况及炎症反应等。

1.4 观察指标  观察三组手术效果，比较三组术前及术后30天、60天、90天碱性磷酸酶活性检测结果，分别于术后30天、60天、90天3个时间点用过量麻醉剂每次随机处死3只家兔，测定骨缺损修复组织中碱性磷酸酶(ALP)活性。

1.5   统计学方法  采用SPSS19.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用t检验P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1    手术效果  三组均未发生全身异常反应。伤口无感染，愈合良好，缝线自行脱落。

2.2    各时间段碱性磷酸酶活性检测结果 术后30天、60天三组碱性磷酸酶较术前显著增高，术后60天达最高峰，之后又逐渐下降。术前三组碱性磷酸酶活性检测结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后30天、60天、90天复合组碱性磷酸酶活性检测结果高于单纯 组和对照组，且单纯组高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表 1    三组各时间段碱性磷酸酶活性检测结果比较 (±s，U/L)

注：与对照组比较，aP<0.05；与单纯组比较，bP<0.05

3讨论

    骨组织工程成为解决大段骨缺损的热点，其中骨生长支架的构成成为其中的难点，它在调控种子细胞募集、血管再生及成骨微环境中发挥重要作用[2-3]。要实现良好的骨再生，需要构建良好的支架结构，通过其空间的拓扑结构及微观尺度差异实现相应的细胞附着及血管内皮生成[4]。因此，仿生骨构建成为了重要的研究方向[5]。本实验通过使用羟基磷灰石／壳聚糖作为材料，打印出载BMP-2活性肽/CXCLl2的梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，与不装载BMP-2活性肽/CXCLl2的单纯梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，分别植入到兔桡骨缺损处，结果证明梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨是载BMP-2活性肽/CXCLl2较为理想的载体，具体原因为羟基磷灰石（HA）具有优异的生物学特性及良好的骨传导性[6]，增加了对成骨细胞的调节能力[7],Chen等[8]运用3D打印技术制备HA-CS生物支架，同时将运载血管内皮生长因子的 HA-CS 支架用于修复兔股骨骨缺损，结果表明相较于单纯HA支架在机械强度和生物降解性方面表现更加优异，具有更好的骨诱导特性，能更好地促进骨的再生和改建。其中微纳米级多级结构抑制免疫排斥反应，减少炎症因子生成，进而提供了促进血管生成的微环境[9]。本实验采用3D生物打印技术，用羟基磷灰石／壳聚糖作为材料，打印出梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨，同步将具有良好控缓释特性的BMP2活性肽和CXCL12纳米囊，按需打印到支架的指定区域，此种梯度渐变3D多孔仿生骨有利于归巢，有利于细胞聚集、分化，归巢对骨缺损再生非常重要。

综上所述，载BMP-2活性肽/CXCLl2梯度渐变3D生物打印多孔仿生骨可提高骨缺损组织中碱性磷酸酶活性，有效促进骨缺损修复。本动物试验研究证明了材料的安全性和有效性，为后续临床试验和应用提供了有效证据。

参   考   文   献

［1］ Shangsi Chen, Yufei Shi, Yun Luo, Jun Ma,Layer-by-layer coated porous 3D printed hydroxyapatite composite scaffolds T for controlled drug delivery . Colloids and Surfaces B: Biointerfaces.2019,179:121–127 .

［2］ ABBASI N, HAMLET S, LOVE RM, et al. Porous Scaffolds for Bone Regeneration. Adva Mater Dev. 2020;5(1):1-9.

［3］ ZHU L, LUO D, LIU Y. Effect of the nano/microscale structure of biomaterial scaffolds on bone regeneration. Int JOralSci.2020;12(1):6.

［4］ FAHMY-GARCIA S, FARRELL E, WITTE-BOUMA J, et al. Follistatin Effects in Migration, Vascularization, and Osteogenesisin vitro and Bone Repair in vivo. Front Bioeng Biotechnol. 2019;1(7):38.

［5］ ZENG JH, LIU SW, XIONG L. Scaffolds for the repair of bone defects in clinical studies: a systematic review. J Orthop Surg Res. 2018;13(1):33.

［6］Lee H, Jang TS, Song J, et al. The production of porous hydroxyapatite scaffolds with graded porosity by sequential freeze-casting[J]. Materials (Basel), 2017, 10(4): 1-12.

［7］ Quan H, He Y, Sun J, et al. Chemical self-assembly of multifunctionalhydroxyapatite with a coral-like nanostructure for osteoporotic bonereconstruction[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2018, 10(30): 25547-25560.

［8］ Chen CY, Chen CC, Wang CY, et al. Assessment of the release of vascular endothelial growth factor from 3D-printed poly-epsilon-caprolactone/hydroxyapatite/calcium sulfate scaffold with enhanced osteogenic capacity [J]. Polymers (Basel), 2020, 12(7): 1-17.

［9］ XIE Y, HU C, FENG Y, et al. Osteoimmunomodulatory effects of biomaterial modification strategies on macrophage polarization and bone regeneration. Regen Biomater. 2020;7(3):233-245.

课题  申报编号：SKJP220202791 

题目：载BMP-2活性肽/ CXCLl2 3D生物打印仿生骨成骨作用及机理研究