Real-time PCR在动物疫病诊断中的应用

Real-time PCR在动物疫病诊断中的应用

朱明月

身份证号：340323198908120105

【摘要】随着我国养殖业向着规模化的方向转变，对于疫病防控的问题要加强重视，而且防控难度和潜在的风险越来越大。对于动物疫情的诊断来说，目前采用的先进监测技术越来越多，但由于流感病毒的增多，也对动物疫病的诊断带来了较多难题。针对这一问题，本文在开展动物疫病诊断的过程中，对如何有效运用Real-time PCR进行了深入探究。对于Real-time PCR来会所，优势在于可以大批量检测、操作便捷、特异性强以及灵敏性高，有非常显著的应用价值。

【参考文献】动物疫病诊断；Real-time PCR；特异性；

在当前社会经济发展背景下，人与自然的和谐相处变得越发重要，其中，作为地球生态系统的重要组成部分，动物与人类的和谐发展也至关重要。尤其是作为我国经济实力的重要组成部分，动物的生存环境导致它们的免疫系统出现了一些问题，存在疫病多样性、复杂性的特点。针对这一现象，需要有一种能够快速检测疫病的技术方法，其中，Real-time PCR以更加显著的应用优势开始广泛应用。

1、动物疫病监测技术的应用价值

动物疫病监测技术是对动物体内感染病原体后产生的抗体进行检测的一种方法。此技术在动物防疫和疫病控制中具有重要的意义，一方面动物疫病抗体检测能够更好地帮助确诊疾病。通过抗体检测可以确定动物是否患有某种疾病。对于一些临床症状不明显或症状相似的疾病，抗体检测可以帮助我们更快速地确认疫病类型，从而采取相应的治疗和预防措施。另一方面确定疫病状况。抗体检测可用于确定动物群体中病原体的传播情况和疫病的流行状况。对于常见的动物疫病，如猪瘟、禽流感等，通过对动物群体进行抗体检测，可以及时防控传染病，减少病害的发生和传播。

2、材料

2.1 主要生物材料

HS-NP、H7-NP、H9-NP、HS-HA和H9-HA质粒(构建质粒的载体均为pHW2000)，除此之外还有H1-HII亚型AIV、IBV、ILTV、NDV和鸡的泄殖腔/喉头混合棉拭子样品以及所有涉及HS亚型禽流感病毒的实验均在扬州大学生物安全防护三级实验室进行。

2.2 主要仪器

7500Fast实时荧光定量PCR仪、LightCycler 480实时荧光定量PCR仪、NanoDrop 2000微量紫外分光光度计、台式高速离心机、高速冷冻离心机、微型离心机、振荡培养箱、电热恒温水温箱、电泳仪、凝胶成像分析仪。

2.3 主要试剂

IIU+One Step q RT-PCR Probe Kit；AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit；QIAprep Spin Miniprep Kit；Easy Pure Viral DNA/RNA Kit；组织/细胞RNA快速提取试剂盒；Transl-T1感受态细胞；平盖八排管(白色)；R Nase-free EP管等。

3、方法

3.1 制备质粒标准品的制备

将实验室已连接载体pHW2000的禽流感病毒NP基因的质粒HS-pHW2000,H7-pHW2000, H9-pHW2000以及禽流感病毒HA基因的质粒HS-pHW2000, H9-pHW2000，按照以下实验流程进行：

（1）质粒转化与挑斑摇菌(净化工作台操作)：①吸取50的T1感受态细胞加入EP管底部，将已连接好的质粒吸取5加入感受态细胞液中，放入冰桶中冰浴30 min；②放入恒温水温箱42℃水浴45 sec，热应激后立即置于冰桶上3 min；③使用胶头滴管滴加10滴无氨解LB培养液；④放入振荡培养箱中190 r/min摇荡1 h；⑤使用台式高速离心机3000 r/min离心2 min，将细胞沉淀下来；⑥弃掉400匹上清液，剩下的液体与沉淀吹打均匀后均匀涂布在氨节LB培养皿上；⑦把氨节LB培养皿放入37℃恒温培养箱培养12-16 h；待氨节LB培养皿上长出分布均匀，圆润，大小适宜的菌落后。⑧吸取2mL氨节LB培养液加入无菌玻璃试管中，夹取无菌白色小枪头挑取1个圆润、大小适宜的单菌落丢进氨节LB培养液中，把玻璃试管放入振荡培养箱220 r/min摇荡12-16 h，直至菌液浑浊。

（2）小提质粒(试剂盒为QIA prep. Spin Mini prep Kit (50)。①将2mL的浑浊菌液转移至EP管，在台式高速离心机12000 r/min离心1min，弃掉上清液，保留管底的白色沉淀物；②吸取250Buffer P1滴加到沉淀物上并吹打混匀；③加入250 Buffer P2，上下颠倒混匀10次左右；④加入350 Buffer N3，上下颠倒混匀10次左右。将Buffer EB放入70℃电热恒温水温箱备用；⑤13000 r/min离心IO min，将上清液转移至试剂盒自带的离心吸附柱中，12000 r/min离心1 min，弃掉收集管中的滤液；⑥加入500

Buffer PB到吸附柱中，12000 r/min离心1 min，弃滤液；⑦加入750 Buffer PE到吸附柱中，12000 r/min离心1 min，弃滤液；重复此步骤一次；⑧将空吸附柱12000r/min离心1 min，甩掉残留Wash Buffer；⑨将离心柱转移至EP管中，在吸附柱底部的白色滤膜中央加入20 Buffer EB，12000 r/min离心1 min，弃掉吸附柱，EP管底部的液体是提取的质粒。

3.2 优化RT PCR反应体系

将引物探针从保存浓度100mo1/L稀释到10mo1/L的工作浓度使用，20L体系，优化引物和探针浓度，引物浓度分别为0.2mo1/L、0.3mo1/L、0.4mo1/L，探针浓度分别为0.15mo1/L、0.20mo1/L、0.25mo1/L，引物探针不同浓度交叉反应分为9组探究最优浓度组合，每个样品2个重复，CT值取均值。具体如下：

55℃15 min(逆转录)；95℃5 min(预变性)；95℃10 sec. 60℃ 34 sec(40个循环)；总反应时间约80 min。

4、结果

4.1 质粒构建结果

将小提质粒后的酶切基因电泳测序结果与目的基因标准序列比对得到100%同源性，表明目的片段已正确连接在质粒中，质粒构建成功。使用NanoDrop2000微量紫外分光光度计测量各阳性质粒标准品的OD 260/280，结果均在1.8-1.9之间，质粒纯度良好，未受其他杂质影响。

4.2 RT PCR反应体系优化结果

探针优化的浓度分别是0.15mo1/L、0.20mo1/L、0.25mo1/L，引物优化的浓度分别0.2mo1/L、0.3mo1/L、0.4 mo1/L，引物探针不同浓度交叉反应分为9组探究最优浓度组合，每个样品2个重复，CT值取均值。

AIV通用型荧光定量RT PCR分别检测H5, H7, H9亚型AIV，当探针NP-Probe浓度为0.25mo1/L引物NP-Forward Primer, NP-Reverse Primer分别为0.2mo1/L时，H5, H7, H9亚型的CT均值最小，扩增效率最佳，由此得到最优反应体系。AIV通用型荧光定量RT PCR最优反应体系为20L。

反应程序：55℃15 min(逆转录)；95℃ 5 min(预变性)；95℃ 10 sec60℃34 sec (44个循环)；总反应时间约80 min。

4.3 符合率

结果显示：鸡胚分离法检测出4份阳性，检出率19.05%；荧光定量RT PCR检测出6份阳性，检出率28.57%；荧光定量RT PCR的检测率高于鸡胚分离法。两种方法均检测出4份阳性和15份阴性，符合率90.48%。鸡胚分离法与HS/H9双重荧光定量RT PCR同时检测AIV，结果显示：鸡胚分离法检测出4份H9亚型，检出率19.05%，未检出HS亚型；荧光定量RT PCR检测出5份H9亚型和1份HS亚型，检出率分别为23.81%和4.76%；荧光定量RT PCR对H5, H9亚型的检测率均高于鸡胚分离法。两种方法均检测出4份阳性和15份阴性，符合率90.48%。

5 讨论

近年来随着科技的发展，实验室检测技术愈发成熟，Real-time PCR已被广泛应用于多种病原的检测，如鹅嵌杯病毒、新型鸭呼肠孤病毒、空肠弯曲菌、伯氏疏螺旋体、猪圆环病毒等。

【参考文献】

[1]魏诗谣. 禽流感病毒通用型和H5/H9双重荧光定量RT-PCR方法的建立与应用[D].扬州大学,2023.DOI:10.27441.

[2]朱彤,商瑞,程凯慧等.H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用[J].病毒学报,2022,38(01):1-7.

[3]杨楠,翟少伦,许军海等.禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立[J].中国动物保健,2021,23(06):101-105.