荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

左荣余

元谋县疾病预防控制中心   651300

摘要：目的：本文探讨了荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用。介绍了手足口病的流行状况和临床表现，以及重要性。PCR技术的基本原理和荧光PCR技术的工作原理、优点和应用场景。阐述了荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的具体应用过程，包括样本采集与处理、荧光PCR引物和探针设计、反应条件和扩增方案，以及结果分析和解读。最后，对比了荧光PCR技术与传统PCR技术及其他核酸检测技术的优势。

关键词：手足口病；病毒核酸检测；荧光PCR技术；应用

引言：手足口病是一种由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生在婴幼儿和儿童中。自1998年首次爆发以来，手足口病在全球范围内持续流行，并且近年来呈现出多发性、高发性和病情严重化的趋势，已成为危害儿童健康的重要公共卫生问题。本研究的目的是探究荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用，并比较其与传统PCR技术及其他核酸检测技术的优势。荧光PCR技术作为一种新型PCR技术，具有扩增速度快、结果直观、自动化程度高等优点，在手足口病病毒核酸检测中具有广阔的应用前景。

一、手足口病及其病毒核酸检测的重要性

（一）手足口病的流行状况和临床表现

手足口病是由肠道病毒引起的急性传染病，主要发生在婴幼儿和儿童中。手足口病的临床表现主要包括：发热、口腔疱疹、手足皮肤疹等，少数患者可发生神经系统并发症。由于手足口病症状轻微，易被误诊为普通感冒或其他疾病，因此准确的病原体检测对于及时诊断和治疗非常重要。

（二）病毒核酸检测在手足口病诊断中的作用

病毒核酸检测是目前最为准确、敏感和特异的手足口病诊断方法之一。具有高灵敏度、高特异性和快速检测能力的新型PCR技术。

二、PCR技术及其荧光化改造

（一）PCR技术的基本原理

PCR(聚合酶链式反应)技术是一种体外扩增DNA片段的方法，通过模拟自然界中的DNA复制机制，利用DNA聚合酶的特殊性质，从少量模板DNA分子中扩增出大量目标DNA片段。PCR技术的基本原理是基于DNA的双链结构、碱基配对原则和DNA聚合酶的特殊性质。

PCR反应主要由三步组成：变性、退火、延伸。变性过程将DNA链解开形成单链，使其成为模板；退火过程是将引物与模板DNA上的互补序列结合；延伸过程是在DNA聚合酶的作用下，引物向两端延伸合成新的DNA链[1]。

（二）荧光PCR技术的工作原理

荧光PCR技术是在传统PCR技术的基础上，添加了荧光探针来实现扩增产物的实时检测。荧光探针通常包含一个末端标记和一个荧光染料。当该探针与靶序列结合后，标记会被酶切释放，从而导致荧光信号的产生。

荧光PCR技术的操作流程主要包括引物设计、反应体系组装、扩增反应、实时监测等步骤。在反应过程中，荧光探针的荧光信号实时被检测并记录，从而可以快速、准确地确定扩增产物的数量。

（三）荧光PCR技术的优点和应用场景

荧光PCR技术可以在较短时间内完成PCR反应，并且无需进行后续电泳分离验证；荧光PCR技术通过实时监测荧光信号的强度，可以直接得到扩增产物的数量和特定性，结果可视化，易于解读；荧光PCR技术可以与自动化设备相结合，实现高通量检测，提高检测效率和准确性。

荧光PCR技术在医学诊断、食品安全监测等领域已经得到广泛应用。例如，在手足口病病毒核酸检测中，荧光PCR技术已经得到了广泛应用，具有高灵敏度、高特异性和快速检测能力。此外，荧光PCR技术还可以实现多重检测，即同时检测多种手足口病病毒亚型，有助于提高检测的准确性和全面性。

三、荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用

（一）样本采集与处理

样本采集需要严格遵守无菌操作原则，使用专用的采样器具进行采集，避免交叉污染。采集后的样本需要立即送至实验室，避免长时间暴露在环境中导致核酸降解。

样本处理主要包括样本的离心、裂解和核酸提取。离心可以去除悬浮的细胞碎片和红细胞，提高核酸的纯度。裂解是将细胞膜破坏，释放细胞内的核酸。核酸提取是利用化学物质或商用试剂盒将核酸从其他组分中分离出来，以便进行后续的PCR反应。

（二）荧光PCR引物和探针设计

引物通常设计在目标序列的两侧，其长度一般在18-30个碱基对之间。引物的Tm值应在50-60℃之间，以保证稳定的引物结合和扩增反应的效果。

探针则设计在引物之间的靶序列上，可以使用荧光染料标记探针的末端。探针的设计需要考虑到其与目标序列的互补性和稳定性，以及荧光信号的产生和检测。

（三）反应条件和扩增方案

反应体系包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液和dNTPs等。其中，聚合酶是关键的酶类，一般选择高度特异性的热稳定DNA聚合酶；PCR反应一般包括变性、退火和延伸阶段。变性温度一般设置在94-98℃，退火温度根据引物设计的Tm值确定，延伸温度一般为72℃。每个阶段的时间根据所用设备和反应体系的不同而有所差异；荧光PCR技术可以实时监测扩增产物的累积情况，并通过荧光信号的强度判断是否存在目标序列

[2]。实时监测可以通过荧光实时定量PCR仪进行，分析则可以利用相关软件或算法进行。

（四）结果分析和解读

荧光PCR技术得到的结果通常以荧光信号的变化曲线形式呈现。根据荧光信号的阈值周期数（CT值），可以判断样本中是否存在目标序列。

CT值越低，表示目标序列的起始量越多，样本中的目标序列含量越高。根据CT值与标准曲线的关系，可以定量计算目标序列的起始量。

在手足口病病毒核酸检测中，可以根据荧光PCR技术得到的结果，判断患者是否感染了手足口病病毒，并评估感染的程度。此外，荧光PCR技术还可以实现多重检测，即同时检测多种手足口病病毒亚型。

四、荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用与其他核酸检测技术的比较

（一）传统PCR技术的局限性

传统PCR技术需要等待PCR反应结束后进行结果分析，耗时较长；由于缺乏实时监测，传统PCR技术容易出现扩增效率低下的情况，影响检测结果的准确性；传统PCR技术需要反复开启和关闭反应管盖，存在着潜在的污染风险，可能导致假阳性结果的产生。

（二）荧光PCR技术的优点和应用场景

实时监测扩增过程中的荧光信号变化，准确记录扩增产物的累积情况，提高检测的灵敏度和准确性；短时间内完成PCR反应，并且可以同时检测多个样品，适用于高通量的检测需求；以荧光信号的变化曲线形式直接呈现，无需进行后续的凝胶电泳或序列分析，简化了实验流程；根据引物和探针的设计，提高检测的特异性，减少假阳性结果的产生[3]。

通过合理选择引物和探针，荧光PCR技术可以实现对手足口病病毒的快速、准确和定量检测。此外，荧光PCR技术还可以用于检测不同亚型的手足口病病毒，对于疫情监测和流行病学调查具有重要意义。

（三）荧光PCR技术与其他核酸检测技术的比较

与传统PCR技术相比，荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中具有更高的灵敏度和特异性，可以更快速、准确地进行病毒检测，为临床诊断和疫情监测提供更好的技术支持。

与其他核酸检测技术如实时荧光定量PCR、循环介导等位基因扩增（LAMP）技术相比，荧光PCR技术具有更高的灵敏度和准确性，更适用于手足口病病毒的快速检测和流行病学调查。

结论

通过实时监测能力、高灵敏度和高特异性，荧光PCR技术可以快速、准确地检测手足口病病毒的存在和感染程度。相比传统PCR技术，荧光PCR技术的实时监测能力可以提高检测的灵敏度和准确性，同时节省了实验时间。此外，荧光PCR技术还可以用于检测不同亚型的手足口病病毒。但也存在设备成本较高、操作技术要求高、样本处理需要专业知识等方面的局限。未来需要从技术改进、多重检测方法、病毒变异监测等方面改进。为手足口病的早期预警、临床诊断和疫情防控提供更加可靠和高效的支持。

参考文献

[1]罗滢娟.荧光PCR技术在手足口病病毒核酸检测中的应用价值分析[J].当代医学,2021,27(23):38-40.

[2]马超阳.荧光PCR技术在手足口病检测中的应用研究[J].中国城乡企业卫生,2019,34(03):75-76.

[3]万华靖.手足口病肠道病毒核酸检测试剂盒研制.四川省,成都新基因格生物科技有限公司,2013-07-27.