高效液相色谱法测定头孢呋辛酯片含量的不确定度分析

高效液相色谱法测定头孢呋辛酯片含量的不确定度分析

陈瑞超 张伟 范福月

山东鲁抗医药股份有限公司 山东 济宁 272000

摘要：头孢呋辛酯属于第二代头孢类口服抗生素，主要用于治疗由敏感细菌引起的疾病，如扁桃体炎、咽炎、急性中耳炎和慢性支气管炎等病症。根据《检测和校准实验室能力认可准则》，实验室在测量结果的有效性、客户需求或测量不确定度可能影响规范合规性的情况下，必须进行不确定度的评估并进行报告。本文主要分析了高效液相色谱法测定头孢呋辛酯片含量的不确定度。

关键词：头孢呋辛酯片；高效液相色谱法；不确定度

一、仪器与试药

1、仪器

Waters e2695型液相色谱仪、2489型紫外光检测器进行分析；测量重量时，采用METTLER TOLEDO XS105型电子天平。所用色谱柱为Agilent Zorbax SB C18，规格为4.6毫米直径、150毫米长度，颗粒大小为5微米。

2、试药

使用的头孢呋辛酯标准品含量为82.5%。试验中的溶剂为色谱级甲醇，而所用的磷酸二氢钾均为分析级。头孢呋辛酯片样本来源于A公司，具体批次号为A202308。实验涉及的水为Milli-Q系统处理过的纯化水。

二、色谱分析

流动相由0.2摩尔每升的磷酸二氢钾溶液与甲醇按62:38的比例混合构成。检测时，设置波长为278纳米，并将供试品溶液及对照品溶液的注入量统一设置为20微升。

三、方法

1、制备供试品溶液

从20片药品中取样并研磨至细粉，确保混合均匀后，取大约相当于125 mg头孢呋辛酯的粉末放入100 mL量瓶中。加入25 mL甲醇以助溶解，并用流动相溶液稀释至标记线，混合后通过滤纸过滤。再取5 mL滤液转入25 mL量瓶，用流动相再次稀释至标记线并充分摇匀，最终得到浓度为每毫升0.25 mg的溶液。

2、制备对照品溶液

从约25 mg的头孢呋辛酯对照品中，准确称重后放入100 mL量瓶中，加入5 mL甲醇溶解，随后使用流动相液体稀释到量瓶的刻度线，摇匀以确保均匀混合，从而得到每毫升含有0.25 mg的溶液。

3、测定

测定步骤包括准确取样供试品溶液和对照品溶液，分别注入液相色谱仪进行分析。色谱图记录基于头孢呋辛酯的两个主要峰的面积总和来计算样本中头孢呋辛酯的含量，使用外标法进行定量。

四、建立数学模型

标示含量（％）=

WR — 头孢呋辛酯对照品称样量；

VR — 头孢呋辛酯对照品溶液稀释体积；

WS — 供试品称样量；

VR — 供试品溶液稀释体积；

— 供试品平均片重；

A — 样品溶液中头孢呋辛酯两主峰峰面积之和；

AR — 对照品溶液中头孢呋辛酯两主峰峰面积之和；

B — 头孢呋辛酯标示量(0.25g为定值，不需考虑不确定度) 。

五、不确定度测定来源

1、制备对照品溶液

1.1 称量引入不确定度

在使用天平进行对照品的称重时，该设备的精确度为0.01 mg，根据制造商提供的说明书，该天平的最大误差限为±0.05 mg。根据误差范围，考虑到均匀分布，计算出不确定度==0.041mg。

在实验中，两次对照品的称量结果分别为29.80 mg和31.16 mg。基于上述数据，引入相对合成标准不确定度为ucr

ucr（）==0.0019

1.2 稀释体积引入不确定度

根据JJG196-2006规程，A级的100 mL量瓶在20°C时允许的最大容量误差是±0.10 mL。假设误差分布是均匀的，从体积误差引入的标准不确定度为：

=0.058ml

在实验室标准温度条件下，通过使用纯化水对100 mL量瓶进行了10次重复定容操作，使用贝塞尔公式得到的标准不确定度u2(VR)为0.05 mL。考虑到实验室温度在15°C至25°C之间波动，与此相关的水的体积膨胀系数平均值为2.04×10^-4 mL/°C。基于均匀分布，膨胀系数导致的标准不确定度还需要计算。

得出：==0.059ml

100ml量瓶引入相对合成标准不确定度为：==0.00097

2、供试品溶液制备

2.1 称量引入不确定度

在使用天平进行供试品精密称重时，该天平具有0.1 mg的使用精度。根据制造商说明书，该天平的最大误差限定为±0.5 mg。考虑到误差分布为均匀，计算得到的标准不确定度为：==0.29mg。通过采用减重法，对每个供试品进行两次称量，进而得到合成标准不确定度：==0.41mg。计算供试品称样量分别为265.1、270.4mg，得出供试品称量相对合成标准不确定度为：==0.0022。

2.2 稀释体积引入不确定度

室温20℃时，5ml移液管取10次纯化水，根据贝塞尔公式，可得出不确定度为：=0.01ml。由于水膨胀系数得出5ml移液管标准不确定度为：==0.0029ml。

最终得出合成标准不确定度为：=

在20℃时，25ml量瓶的最大容量误差在0.03ml左右，根据均匀分布要求，体积误差引入标准不确定度为：

==0.017ml

在该室温条件下，对25ml量瓶进行10次重复定容处理，则标准不确定度为：

=0.02ml

2.3 平均片重引入不确定度

取20片进行称量，天平的精度控制在0.1mg，则可得出天平不确定度为：

==0.29mg

分别称量20片药物的重量，并根据公式计算标准不确定度为：

=1.7mg

根据平均片重得出的标准不确定度为：==1.7mg

2.4 对照品色谱峰面积重复引入不确定度

对2份对照品溶液进行评定测定，则可以计算两份药物主峰的峰面积分别为13 251 449、13 208 012 和 13 873 541、13 872 821，然后应用极差法，得出两份溶液的极差分别为RR1 =43437、RR2 =720。最终计算出相对合成不确定度：

==0.0021

2.5 供试品色谱峰面积引入不确定度

在进行头孢呋辛酯含量测试时，对两个不同的供试品溶液各进行了两次平行测定。测得两主峰的总峰面积结果为：对于第一份溶液，两次测量的峰面积分别为13,257,691和13,237,688；对于第二份溶液，峰面积分别为13,440,147和13,436,093。利用极差法进行计算两份溶液的平均峰面积值分别为13,247,680和13,438,120。得出相对合成标准不确定度为：

==0.00096

最后得出头孢呋辛酯片的含量测定结果均值96.27％。

根据上述标准不确定度可以得出相对标准的不确定度为：

=

=0.006

最终的标示含量=96.27% ±1.16%(k=2)

六、讨论

在本次试验中，对头孢呋辛酯片的含量进行测定，并对引入不确定度进行分析。通过评估不同的不确定度来源，发现实验室可控的因素包括：使用更高精度的天平以减少对照品和供试品称量误差；选用更高等级的量具如量瓶、移液管等以降低由此引入的不确定度；通过维护稳定的实验室环境温度，控制溶液体积变化；定期检定并维护高效液相色谱仪，提高检测重复性。尤其是由稀释体积和平均装量引起的不确定度在各个分量中占比最高，应成为实验控制重点。此外，对不确定度的评定不仅是检测实验室的基本要求，出具结果时也需附带不确定度报告。

参考文献

[1]黄婧. 高效液相色谱法测定头孢呋辛酯片含量的不确定度评定[J]. 中国药品标准, 2021, 22 (06): 583-586.

[2]彭洁, 郑传奇, 陈冬妮, 洪建文. HPLC法测定头孢呋辛酯及制剂中小分子有关物质及聚合物[J]. 中国抗生素杂志, 2018, 43 (02): 206-210.

[3]钱璟. TSK凝胶色谱系统测定头孢呋辛酯片的高分子聚合物[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26 (14): 2020-2022.