(中抗生物制药(海口)有限公司 海南海口 570311)
摘要:目的:通过市售的即用型培养皿不同批次的培养皿暴露一定时间后,根据其培养皿的失水率和适用性结果,以证明单个即用平皿连续采样最长4小时仍满足微生物生长要求。方法:采用3个批次,φ90mm,装量为25ml即用TSA平皿,在风速较大的A级区域模拟日常沉降菌分别连续采样0.5h、1h、2h、3h、4h、5h后测试不同时间段失水率及接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉进行适用性检查;结果表面最长暴露5h失水率最大为15.44%,暴露5h后微生物生长均符合要求。结论:本次研究证明即用平皿暴露4小时内能满足微生物生长。
关键词:即用平皿、失水率、适用性
根据制药行业GMP法规要求,对生产无菌药品的洁净环境在线监测和动态监测,尤其是无菌灌装过程,需对整个生产过程进行微生物监控,以及国标规定培养皿的暴露时间不大于4h,故制药行业中会出现单个培养皿最长采样4小时的情况。培养皿暴露时间过长会造成失水过多导致培养皿无法满足微生物生长,出现假阴性结果。通过对平皿暴露实验,证明平皿暴露4小时后其仍能满足微生物生长,保证采样结果的准确性及可靠性。
1仪器、设备及物料
ML802百分之一电子天平、SPX-250B-Z型生化培养箱、3批市售φ90mm规格的胰蛋白胨大豆琼脂培养基,试验菌株:金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)枯草芽抱杆菌(CMCC(B)63501)、白色念珠菌(CMCC(F)98001)、黑曲霉(CMCC(F)98003)。
2目的
培养皿随着暴露时间的延长,会因为失水等原因影响微生物正常生长,培养皿的准确性对监测结果有关键性影响,选取三个批次的培养基进行最长暴露试验,确认市售即用培养皿在要求的暴露时间内期培养基水分及适用性仍符合微生物生长。
3试验方法与结果
3.1失水率试验
将A级区域送风风速调节至标准上限,待风速稳定后,温湿度控制在18~26℃、30~65%。每个批号φ90mm,装量25ml,即用平皿各98块,每批分为0.5h、1h、2h、3h、4h、5h暴露时间的平皿各14块,剩余14块平皿不经暴露作为阴性对照。做好标记后,使用百分之一的天平进行称重,并记录重量W0。均匀铺设在层流下方操作台表面打开各个碟盖,按沉降菌监测方法操作,开始计时。阴性对照平皿无需称量。
分别暴露0.5h、1h、2h、3h、4h、5h时,立即盖上原盖密封进行称重,记录重量Wt,按以下公式计算各暴露时间后培养皿的失水率。
W0-Wt
失水率= ×100%
W0
3.2暴露后平皿适用性检查
将暴露2h、3h、4h、5h的平皿,每个时间点的平皿分别接种5种菌株(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽抱杆菌、白色念珠菌、黑曲霉),分别接种不大于100cfu的试验菌悬液至培养基,每株试验菌平行制备2个皿,放置生化培养箱中按相应的培养温度和时间培养,培养结束观察并计数。
可接受标准:经暴露后的平皿接种后的菌落形态应与对照培养基上的菌落一致,微生物回收比值在0.5~2范围内为合格。
3.3失水率测试结果
平均失水率测试结果(%) | |||
温湿度 | 21.2℃,49% | 23.0℃,48% | 21.8℃,54% |
暴露时间 | 第一批 | 第二批 | 第三批 |
0.5h | 1.53 | 1.40 | 1.60 |
1h | 2.30 | 2.32 | 3.14 |
2h | 3.61 | 4.79 | 5.03 |
3h | 6.80 | 7.24 | 7.59 |
4h | 9.28 | 8.89 | 9.53 |
5h | 13.48 | 15.44 | 13.37 |
3.4培养基适用性结果
培养基适用性结果 | ||||||
批次 | 第一批 | 第二批 | 第三批 | |||
菌种 | 回收比值 | 菌落形态 是否一致 | 回收比值 | 菌落形态 是否一致 | 回收比值 | 菌落形态 是否一致 |
暴露2h微生物回收比值及结果 | ||||||
S.a | 1.20 | 是 | 1.02 | 是 | 0.79 | 是 |
P.a | 1.00 | 是 | 0.65 | 是 | 0.92 | 是 |
B.st | 1.02 | 是 | 1.16 | 是 | 1.09 | 是 |
C.a | 0.72 | 是 | 0.92 | 是 | 0.88 | 是 |
A.n | 1.34 | 是 | 0.89 | 是 | 1.10 | 是 |
菌种 | 暴露3h微生物回收比值及结果 | |||||
S.a | 1.28 | 是 | 1.12 | 是 | 0.93 | 是 |
P.a | 0.92 | 是 | 0.87 | 是 | 1.34 | 是 |
B.st | 0.91 | 是 | 1.27 | 是 | 0.81 | 是 |
C.a | 0.81 | 是 | 1.02 | 是 | 0.86 | 是 |
A.n | 1.07 | 是 | 1.00 | 是 | 1.15 | 是 |
菌种 | 暴露4h微生物回收比值及结果 | |||||
S.a | 1.15 | 是 | 1.12 | 是 | 0.79 | 是 |
P.a | 0.75 | 是 | 0.95 | 是 | 1.13 | 是 |
B.st | 1.04 | 是 | 0.97 | 是 | 0.92 | 是 |
C.a | 0.81 | 是 | 0.92 | 是 | 0.95 | 是 |
A.n | 1.10 | 是 | 1.02 | 是 | 0.95 | 是 |
菌种 | 暴露5h微生物回收比值结果 | |||||
S.a | 1.02 | 是 | 1.07 | 是 | 0.95 | 是 |
P.a | 0.61 | 是 | 0.80 | 是 | 0.94 | 是 |
B.st | 1.13 | 是 | 1.13 | 是 | 0.77 | 是 |
C.a | 0.88 | 是 | 1.15 | 是 | 1.02 | 是 |
A.n | 1.26 | 是 | 0.80 | 是 | 1.12 | 是 |
通过不同批次的培养皿最长暴露5h后失水率在13.37~15.44%之间,5种菌种回收率均合格,可证明即用培养皿暴露4h内其失水率仍满足微生物生长,其监测结果准确可靠。
4讨论:
不同批次的培养皿制备过程中培养皿薄厚会有细微差异,此差异可能会影响培养皿暴露后失水率效果,但是在一定失水率范围,培养皿的适用性仍符合要求,其培养皿用于4小时的沉降菌监测,结果是准确可靠的。
参考文献:
[1]《药品生产质量管理规范》(2010版修订版)附录1 无菌药品
[2]中国国家标准化委员会.GB/T 16294-2010 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法[s]北京:中国标准出版社.2010.
[3] | 中华人民共和国药典: 四部[S].2020 |
[4]宋倩倩. 胰酪大豆琼脂培养基平皿暴露时长研究[J].生物化工,2016(000)003
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