长链非编码RNA Hotair通过调控巨噬细胞表型转换促进胃癌细胞增殖与侵袭

长链非编码RNA Hotair通过调控巨噬细胞表型转换促进胃癌细胞增殖与侵袭

杨孟选

上海市闵行区中心医院  外科  201199

【摘要】目的：分析长链非编码 RNA Hotair 是否在胃癌细胞当中产生对巨噬细胞的作用，由此形成更多的癌症支持细胞，加速胃癌的增殖、侵袭。方法：纳入胃癌患者的时间段为2021年8月至2022年9月，纳入胃癌患者总例数100例。所有患者病变组织切除后，将其存储在恒温-80℃的环境下。本次研究按照实验内容的差异对组别进行划分， 其中共培养实验的组别包括AGS 细胞组、参照组，转染实验的组别包括参照组、Hotair 过表达组和 RNA 干扰组。通过开展共培养实验，对巨噬细胞的表型转换进行检测。通过原位杂交实验，对 M2 型巨噬细胞与 lncRNA Hotair 进行共定位处理；在 RT- PCR 实验的支持下，实现对巨噬细胞表型转换的 lncRNA检测、筛选；在 RNA 干扰技术的支持下，将胃癌细胞 lncRNA 水平敲低，敲低完成后组织共培养实验。为进一步检测癌症巨噬细胞转型后对胃癌细胞增殖、侵袭产生的实际影响，将研究数据代入统计学软件，并将输出结果进行对比分析，P<0.05说明结果具有突出的差异性。结果：巨噬细胞不同表型数量，炎症相关因子水平，巨噬细胞lncRNA水平，流式细胞不同表型细胞比例、450 nm 吸光度、侵袭细胞数量组间对比结果差异突出（P<0.05）。结论：在巨噬细胞的作用下，胃癌细胞当中的lncRNA Hotair被吞噬，为临床胃癌治疗提供了全新的突破口。

【关键词】胃癌细胞；巨噬细胞；lncRNA

lncRNA 在癌症临床治疗中，对于调节细胞功能具有重要作用，具体表现为lncRNA 能够对癌症相关通路进行调节，可作为癌症临床治疗的重要依据。临床中认定肿瘤细胞当中含有大量的巨噬细胞，在一定程度上会加速肿瘤的发展。通过本次研究，验证胃腺癌细胞在lncRNA Hotair下，将其中的巨噬细胞转换为癌支持巨噬细胞，加速胃癌细胞的增殖、侵袭，为胃癌临床治疗提供新思路。

1一般资料与方法

1.1研究资料

（1）胃癌患者：在2021年8月至2022年9月期间，纳入100例胃癌患者。所有患者病变组织切除后，将其存储在恒温-80℃的环境下。

（2）细胞系：AGS 人胃腺癌细胞（上海研生实业有限公司）。

（3）实验试剂：DMEM/F12 培养基（赛默飞世尔科技），胎牛血清（赛默飞世尔科技），Lipofectamine2000（赛默飞世尔科技），IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 与 IL-10 ELISA 试剂盒（上海原鑫生物科技有限公司），Hotair 质粒与 siRNA（武汉淼灵生物科技有限公司）。

（4）实验动物：出生4个月的 SD 大鼠（百奥赛图江苏基因生物技术）。

1.2研究方法

（1）细胞系培养转染

取体积分数为 10%的胎牛血清、体积分数为1%的青霉素-链霉素，将其加入至 DMEM/F12 培养基，将AGS 人胃腺癌细胞培养在培养基中，恒定培养环境温度为37℃、CO2体积分数5%。Hotair的 特异性引物：

上游。5'-CATGGATCCACATTCTGCCCTGATTTCCGGAACC-3'；

下游。5'-ACTCTCGAGCCACCACACACACACAACCTACAC-3'。

Hotairsi的RNA序列：5'-GCGCCUUCCUUAUAAGUAUTT-3'。

（2）巨噬细胞分离、培养

从大鼠腹腔中提取巨噬细胞：①在 SD 大鼠的腹腔中注射PBS磷酸盐缓冲液（福州迈新生物技术开发有限公司 ，闽榕食药监械(准)字2012第1400001号），预先在PBS中混入青霉素和链霉素。注射完成2min后，从大鼠腹内抽取液体，将液体加入离心机中，设定离心机转速1000r/min，持续离心时间为5min。在红细胞裂解液中重新悬浮巨噬细胞持续2min，随后再次组织离心，保持离心条件不变，离心完成后在含有10%FBS 的 RPMI1640 培养基中培养巨噬细胞，持续培养3h后将无贴壁细胞去除。在后续的培养过程中，按照2d/次的频率更换培养基。

（3）共培养实验

以Transwell 小室为试验环境、以巨噬细胞与 AGS 人胃腺癌细胞为实验材料，组织开展共培养实验。参照组：按照1×10 5 个/孔的密度，在孔径为0.4 μm的24 孔 Transwell 板上室当中加入巨噬细胞；AGS 细胞组：以执行参照组相关操作为前提，按照1×10 5 个/孔的密度在Transwell 板下室中加入AGS 细胞。持续培养时间为3 d，培养后开展后续检测。

（4）指标检测

1. 细胞侵袭实验

AGS 细胞的侵袭迁移能力测定方式为，被Matrigel 基质胶包裹的Transwell 小室。在Transwell 上室当中加入100 μl 无血清培养基 AGS 细胞悬液，在Transwell下室中加入体积分数为10%、600 μl的胎牛血清

[1]。持续培养24h后将血清取出，使用PBS 溶液冲洗Transwell 小室并使用甲醇持续固定30min，使用体积分数为0.1%的结晶紫持续染色20min。

2.细胞增殖检测

细胞增殖检测方式为 CCK-8 试剂盒，将不同组别AGS 细胞贴壁在96 孔板并持续培养48h，孔板各孔中加入的 CCK-8 试剂量为10μl，加入后持续培养2h，培养完成后通过酶标仪对459 nm处的吸光度进行测定。

3.细胞免疫荧光染色

在细胞爬片上种植不同组别的巨噬细胞，种植完成后使用体积分数为4%的多聚甲醛进行固定，固定完成后在恒温4℃的条件下使用CD86一抗孵育巨噬细胞持续12h，孵育完成后在室温环境下运用Alexa Fluor 568 标记的二抗持续染色1h，同理对细胞表面CD206进行标记，标记完成后使用荧光显微镜观察并拍照。

4. 胃癌组织原位杂交实验

取出胃癌患者切除并经过石蜡包埋的病变组织，对其进行切片处理。将组织切片置入浓度为10mmol/L的柠檬酸溶液当中，直至柠檬酸溶液沸腾，保持沸腾状态持续10min对抗原进行修复处理[2]。使用浓度为 2 ng/μl 且被荧光标记的 HotaircDNA 探针溶液持续孵育24h，再使用 CD206 抗体免疫荧光染色巨噬细胞，为共定位巨噬细胞、 lncRNA Hotair创造条件。

5.酶联免疫吸附测定

96 孔板当中的细胞数量达到5×10 5 个时，通过ELISA 实验对炎症相关因子的水平予以检测[3]。运用标准品对各炎症因子标准曲线进行绘制，组织细胞经过24 h培养后取上清液，通过双抗夹心法对 IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 、IL-10 浓度予以测定。

6.流式细胞术

通过流式细胞术对巨噬细胞的表型转化予以检测，不同组别的抗体染色方式为：通过APC对CD86抗体进行标记、通过FITC予以CD206 抗体染色处理。完成染色后在各组别中选取1×10 5 个细胞并置入100 μl 流式缓冲液中进行重新悬浮，通过Accuri C6 流式细胞仪检测重新悬浮后的细胞。

7.RNA 提取、RT-PCR定量

通过TRIzol 将细胞中RNA提取出来，并在cDNA 合成试剂盒下完成cDNA第一链的合成。 在 CFXConnect 荧光定量 PCR 检测系统加入SYBR Green I 染 料，以此开展 RT-PCR，对GAPDH 进行归一化处理。GAPDH引物序列：

上游：5'-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3'；

下游：5'-ATTCGGAGAAGGGAGGGCT-3'；

PICSAR引物序列：

上游：5'-TGCCTGGACTTTCAAGAGGTAA-3'；

下游：5'-GCTCTCAGTCAGCAGACACTT-3'。

8.细胞增殖检测

通过CCK-8 试剂盒对细胞增殖进行检测， AGS 细胞在Transwell 上室持续贴壁培养48h，随后在Transwell 上室的每个孔中加入CCK-8 试剂30 μl ，持续培养2h，培养完成后使用酶标仪对450 nm 处的吸光度进行测定。

1.3观察指标

研究进行期间对不同组别的巨噬细胞CD86、CD206表型数量进行统计；对不同组别的IL-1β、IL-6、IL-4、TNF-α、TGF-β 、IL-10 水平进行测定；检测各组别的Hotair 、PICSAR水平。分别将Hotair 过表达组、 RNA 干扰组的CD86 、CD206 、450nm吸光度、侵袭细胞数量与参照组进行对比。

1.4纳入与排除标准

（1）纳入标准：①患者脏器功能正常；②患者免疫功能正常；③患者血液健康；

（2）排除标准：①患者伴有严重的脏器功能不全；②患者伴有传染病、免疫性疾病；③患者伴有血液功能障碍。

1.5统计学分析

在SPSS28.0中代入研究数据，研究连续资料（）检验方式为t，输出结果显示P<0.05，表明差异具有突出性。

2结果

2.1巨噬细胞不同表型数量组间对比

表1为巨噬细胞不同表型数量组间对比。巨噬细胞不同表型数量组间对比差异突出（P<0.05），表现为CD206巨噬细胞数量超过参照组，由此推断AGS 细胞组中，巨噬细胞向癌支持细胞的转换率更高。

表1 巨噬细胞不同表型数量组间对比[（），个]

2.2炎症相关因子水平组间对比

表2为炎症相关因子水平组间对比。AGS 细胞组当中的巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6水平下降， TGF-β、IL-4 、IL-10水平升高，使得炎症相关因子水平组间对比表现出突出性差异（P<0.05）。该结果同样验证了AGS 细胞组中更多的巨噬细胞成功转换为癌支持细胞。

表2 炎症相关因子水平组间对比[（），pg/ml]

续表：

2.3巨噬细胞lncRNA水平组间对比

表3为巨噬细胞lncRNA水平组间对比。AGS 细胞组当中的Hotair水平、超过参照组，组间对比差异突出(P<0.05)，PICSAR组间对比无差异（P>0.05）。表明在AGS 细胞组中检测到更多的巨噬细胞lncRNA，断定AGS 细胞组中的巨噬细胞数量相比参照组更多，推断Hotair的重要性超过PICSAR。

表3 巨噬细胞lncRNA水平组间对比

2.4流式细胞不同表型细胞比例、450 nm 吸光度、侵袭细胞数量组间对比

表4为流式细胞不同表型细胞比例、450 nm 吸光度、侵袭细胞数量组间对比。Hotair 过表达组在视野范围内共有326.91±34.63个细胞侵袭至下室，超过对照组侵袭至下室的细胞数量174.82±24.25个，CD86比例小于参照组，CD206比例、450nm吸光度均超过参照组，组间对比差异性突出（P<0.05）。RNA 干扰组侵袭至下室的细胞数量为126.77±21.86个，CD206比例、450nm吸光度均低于参照组，CD86比例超过对照组，组间对比差异性突出（P<0.05）。

表4 流式细胞不同表型细胞比例、450 nm 吸光度、侵袭细胞数量组间对比

续表1：

续表2：

续表3：

3讨论

世卫组织全球癌症统计报告当中数据显示，截至2020年全球范围内的胃癌患者高达108.9万例，其患者总例数在众多类型的癌症当中排名第五，同年的胃癌死亡病例高达76.9万例，其死亡例数在众多类型的癌症当中排名第四，预计2024年全球范围内的胃癌患者总数将上升至177万例。

鉴于胃癌对人类健康造成的严重危害，临床中长期致力于胃癌治疗。胃癌的特异性诊断标志物对于胃癌治疗具有重要意义，胃癌肿瘤的发展易受到局部微环境变化的影响，因此肿瘤细胞会通过改变微环境的方式创造更有利于自身发展的环境，巨噬细的M1 表型在巨噬细胞的作用下转化为M2 表型癌支持细胞，为肿瘤增殖创造条件[4]。长链非编码RNA为肿瘤细胞改变周边环境提供支持，在此次研究中假定胃癌细胞在lncRNA的作用下改变巨噬细胞的表型。

本次研究验证了AGS 细胞中的巨噬细胞，能够在 CD86作用下向 CD206 抗炎细胞转换。在共培养实验中，对巨噬细胞与AGS 细胞进行共同培育，巨噬细胞经过培育后所分泌的促炎因子数量减少、分泌的抗炎因子数量更多，验证了巨噬细胞的表型转换。通过深入分析发现， lncRNA在巨噬细胞的表型转换中起到重要作用，不同组别胃癌细胞的Hotair 与 PICSAR差异进行对比，结果表明AGS 细胞组当中的 Hotair 水平与参照组对比差异突出（P<0.05），而PICSAR组间对比无差异（P>0.05），由此推断巨噬细胞的表型转换中起到关键作用的lncRNA成分是Hotair。

在lncRNAHotair 的作用下，胃 癌 细 胞促进肿瘤微环境当中炎性巨噬细胞向抗炎癌支持细胞转变，使胃癌的增殖、转移更加顺利，为胃癌临床治疗提供支持。

参考文献

[1]徐慧鲜,刘振锋.GLS1基因调节胃癌细胞迁移、侵袭和EMT的研究[J].河北医药,2023,45(13):1935-1940.

[2]张小莉,王秀平,邵世和等.MicroRNA-1184在胃癌细胞中的表达及作用[J].临床检验杂志,2023,41(05):327-334.

[3]吴佳明,邓忠权,朱奕等.MicroRNA-431-5p在胃癌组织中低表达：基于线粒体和Bax/Bcl-2/caspase3信号通路[J].南方医科大学学报,2023,43(04):537-543.

[4]王文婷,胡杨志,张芡等.二甲双胍与胃癌细胞的增殖、迁移及上皮-间充质转化之间的关系[J].西部医学,2022,34(04):516-519+524.                                   

课题编号：2020MHZ040