LC-MS/MS 法同时测定人脑脊液中盐酸万古霉素和美罗培南的浓度及其在治疗药物监测中的应用

LC-MS/MS 法同时测定人脑脊液中盐酸万古霉素和美罗培南的浓度及其在治疗药物监测中的应用

朱斌1，徐宗良2，王瑞冬3，李盛建4，周瑾4，赵亮4，钱跹4*通讯作者

1.上海市宝山区仁和医院 神经外科，上海 200433；  2.上海大学医学院，上海 200444；   3.海军军医大学第三附属医院临床研究院，上海，200438; 4.上海市宝山区罗店医院 药剂科，上海 201908

[摘要] 目的 建立高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)同时测定人脑脊液中盐酸万古霉素和美罗培南的浓度，并将其应用于颅脑手术患者的治疗药物监测。方法 脑脊液样品经蛋白沉淀后测定，使用ADME色谱柱，柱温为35 ℃，流动相为0.1%甲酸水溶液(A相)、甲醇(B相)，采用梯度洗脱(0-1 min，5% B；1-1.5min 5%-59% B；1.5-4min，59% B)，流速为0.4 mL·min-1，正离子模式下进行多反应监测(MRM)盐酸万古霉素(m/z 725→144)；美罗培南(m/z 383.8→141)；内标替诺福韦(m/z 287.8→176)。 结果 人脑脊液中盐酸万古霉素及美罗培南在1-2000 ng/mL浓度范围内线性关系良好，提取回收率分别为85.62%-96.78%，92.09%-101.84%，日间及日内精密度的RSD均小于15%，稳定性考察良好。采用建立的方法检测了34例颅脑手术患者静脉输注万古霉素和美罗培南后的脑脊液浓度，测得盐酸万古霉素浓度范围为215.6-3045.20 ng/mL，美罗培南浓度为1.5-238.59 ng/mL。结论 所建立的LC-MS/MS检测方法专属性强、灵敏度高、准确性好，可实现对盐酸万古霉素和美罗培南的快速定量测定，满足临床治疗药物浓度监测需求。

[关键词] 高效液相色谱-串联质谱；盐酸万古霉素；美罗培南；定量测定；治疗药物监测

颅内感染是颅脑手术之后容易发生的一种严重并发症，颅内感染的发生不仅会使患者的原有疾病的疗效受到影响，严重情况下甚至危及患者的生命[1, 2]。临床中颅脑手术患者在手术前会预防性使用抗生素，抗生素的使用导致脑脊液的细菌培养和涂片结果多数为阴性，出现无法准确选择有效抗生素的情况，因此临床医师通常经验性选用万古霉素联合美罗培南治疗颅内感染[3, 4]。

在针对不同感染部位、不同的耐药菌菌株的复杂情况中，美罗培南与万古霉素的MIC也存在较大差异，导致不同患者对于美罗培南与万古霉素的最适给药方案可能存在较大差异。因此对美罗培南与万古霉素开展治疗药物检测，进行个体化用药是临床精准用药不可或缺的手段，具有重要的临床现实意义[3, 5, 6]。

高效液相色谱联用质谱法（HPLC-MS/MS）因其能够对生物样本进行高效、快速、准确的分析被用作临床进行治疗药物监测的常用手段，目前已有美罗培南在人脑脊液中的HPLC-MS/MS定量方法、而对于万古霉素只存在人血浆中的定量方法，尚未有脑脊液样本中的定量方法，且并未有对于美罗培南与万古霉素在人脑脊液中的同步定量方法的报道。本文旨在建立一种快速准确的美罗培南与万古霉素在人脑脊液中同步定量的HPLC-MS/MS方法，并将其应用于临床颅脑手术患者的治疗药物监测。

1. 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1290 UPLC液相色谱仪、Agilent 6470三重四级杆质谱仪（Agilent Technologies，美国）；Fresco 21 低温离心机（Thermo Fisher，美国）；VORTEX-5旋涡混合器（Kylin-bell）；SECURA125-1CN型十万分之一电子天平（Sartorius，德国）；Arium@ mini 超纯水机（Sartorius，德国）。

1.2 试药

盐酸万古霉素对照品（≥98%，北京索莱宝，批号：721G021）；美罗培南对照品（≥98%，中国食品药品检定研究院，批号：130506-202103）；替诺福韦对照品（99%，大连美仑，批号：J0322AS）；甲酸为色谱纯（Adamas，中国，批号P2334086）；甲醇为质谱纯（Honeywell，美国，批号EA422-CN）；水为超纯水。

2. 方法与结果

2.1 色谱条件 

SHISEIDO ADME（3.0×100 mm，2.7 μm），0.1%甲酸水（A）-甲醇 （B）流动相，梯度洗脱(0-1 min，5% B；1-1.5min 5-59% B；1.5-4min，59% B)，流速0.4 mL·min-1，柱温35℃，进样量5 μL，运行时间4 min。

2.2 质谱条件

采用AJS ESI正离子化，离子源参数：干燥气温度300 ℃、干燥气流速10 L·min-1、雾化器压力45 psi、鞘气温度350 ℃、鞘气流速11 L·min-1、毛细管电压3500 V、喷嘴电压500 V。多反应离子监测，用于定量分析的离子通道分别为m/z：725→144 (盐酸万古霉素)；m/z：383.8→141（美罗培南）；m/z：287.8→176（内标替诺福韦）。

2.3对照品溶液和内标溶液的制备

精密称取盐酸万古霉素、美罗培南、替诺福韦对照品适量，分别用甲醇配制得浓度为1.00 mg/mL的储备液，于-20 ℃储存。用适量甲醇稀释内标储备液，得到浓度为200 ng/mL的内标工作溶液，于-20 ℃储存。

2.4 脑脊液样品前处理方法

取50 μL脑脊液于1.5 mL离心管中，加入50μL内标工作溶液、100 μL甲醇溶液作为提取溶剂，涡旋60 s，5℃条件下13 000 g·min-1离心5 min，取上清液100 μL加入1.5 mL离心管中，再加入100 μL的纯水混匀，取100 μL于进样瓶，放入自动进样器中进样分析。

2.5方法学验证

2.5.1专属性

取空白脑脊液50 L，按“2.4”项下操作，进样5 L，获得相应的双空白样品的色谱图，结果见图1。取定量下限浓度的盐酸万古霉素和美罗培南标准含药脑脊液50 L，按“2.4”项下标准曲线样品处理方法操作，进样5 L，获得相应的模拟样本的色谱图，结果见图2。取临床试验收集的脑脊液样品50 L，按“2.4”项下待测生物样品处理方法操作，进样5 L，获得相应的脑脊液样本的色谱图，结果见图3。

结果表明，空白脑脊液中的内源性物质与被分析物达到基线分离，不影响测定；并且内标不影响被分析物的测定，符合生物样品分析要求。

图1  空白样品的典型色谱图

Fig 1 Typical chromatograms of blank sample

（第一通道：总离子流，第二通道：美罗培南，第三通道：替诺福韦，第四通道：盐酸万古霉素）

图2  模拟样品的典型色谱图

Fig 2 Typical chromatograms of simulated sample

（第一通道：总离子流，第二通道：美罗培南，第三通道：替诺福韦，第四通道：盐酸万古霉素）

图3  盐酸万古霉素和美罗培南脑脊液样品的典型色谱图

Fig 3  Typical chromatograms of vancomycin and meropenem in human CSF

（第一通道：总离子流，第二通道：美罗培南，第三通道：替诺福韦，第四通道：盐酸万古霉素）

2.5.2标准曲线与线性范围

取空白脑脊液190 µL，精密加入盐酸万古霉素和美罗培南系列混合标准溶液10 µL，涡旋混匀，配成盐酸万古霉素和美罗培南浓度均为1，2，5，20，50，200，1 000，2 000 ng/mL的标准含药脑脊液。取50 µL按“2.4”项下操作，进样分析，记录色谱图，计算盐酸万古霉素和美罗培南峰面积与内标峰面积的比值。

以脑脊液中待测物浓度(X)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，用1/X权重进行回归计算，盐酸万古霉素回归方程为：Y=2.908972E-004X+8.066018E-005，R2=0.999 9，线性范围为1-2 000 ng/mL；美罗培南回归方程为：Y=0.003526X-9.045986E-004，R2 = 0.999 7，线性范围为1-2 000 ng/mL。

盐酸万古霉素和美罗培南标准曲线的线性关系良好，权重因子在整个方法验证中保持一致，符合生物样品分析要求。

2.5.3精密度与准确度

稀释储备溶液加入到脑脊液中分别得到盐酸万古霉素和美罗培南浓度均为2.5 ng/mL（LQC）、800 ng/mL（MQC）、1600 ng/mL（HQC）的质控样品, 每个浓度平行制备 6 份，样品前处理后进样，进样测定，记录峰面积，以测得值/真实值×100% 计算准确度，以测量值的相对标准差计算精密度，连续3天测定考察日间精密度和准确度。在3个浓度中，盐酸万古霉素、美罗培南质控样品的准确度RE分别在94.15%～100.38%、95.73%～105.33%范围内，质控样品的日内、日间RSD均小于15%，说明精密度与准确度良好，见表1。

表1 精密度与准确度测定（）（n=6）

Tab 1 Precision and accuracy of vancomycin and meropenem （）（n=6）

2.5.4 基质效应和提取回收率

分别取 6 份来自不同健康人的空白脑脊液，每份脑脊液制备低、中、高三种浓度的质控样品，以其待测物的峰面积作为set1；取空白人脑脊液先用甲醇作为沉淀剂处理后，取上清液按“2.4”中的方法操作，使之浓度与Set1的待测理论浓度一致，其待测物峰面积Set2，；将美罗培南和盐酸万古霉素储备溶液用甲醇稀释，使之与Set 1待测理论浓度一致，其待测物峰面积作为Set3，内标物同法操作。基质效应的计算为Set2/Set3，提取回收率的计算为Set1/Set2。盐酸万古霉素与美罗培南在三个浓度下内标归一化的基质效应因子均小于15%，说明样品测定不受基质影响。在三个浓度下，盐酸万古霉素的提取回收率为85.62-96.78%，美罗培南的提取回收率为92.09-101.84%，见表2。

表2 基质效应与提取回收率 (n=6)

Tab 2  Matrix effect and extraction recovery rate of vancomycin and meropenem (n=6)

2.5.5稳定性试验

制备3种浓度质控样品，按“2.4”项进行前处理之后进样测定，分别考察含药脑脊液样品室温放置1 h、-80 ℃ 3次冻融循环、样品前处理后自动进样器4 ℃放置24 h，以及脑脊液样品-80 ℃储存30天的稳定性。平行测定6份，不同条件下稳定性均良好，见表3。

表3 脑脊液中盐酸万古霉素与美罗培南的稳定性（）(n=6)

Tab 3  Stability of vancomycin and meropenem in human CSF （）(n=6)

2.6 稀释可靠性

部分样品中万古霉素的浓度超过2 000 ng/mL，故考察稀释效应。照“2.3”项下配制盐酸万古霉素和美罗培南浓度均为10 000 ng/mL的混合模拟样品，取该模拟样品50 μL，加入空白脑脊液450 μL，稀释为盐酸万古霉素和美罗培南浓度均为1 000 ng/mL的稀释样品。测定稀释样品的浓度评估盐酸万古霉素和美罗培南的稀释效应。结果显示盐酸万古霉素的RE在93.41-105.61%；美罗培南RE在96.70-105.03%，两者的RSD均小于15%，符合检测要求，表明样品稀释10倍后可以准确定量。

2.7 临床应用

采用本研究建立的方法对7例颅脑手术患者34份样本进行治疗药物监测，测定其脑脊液中盐酸万古霉素与美罗培南的浓度。术中给药前后采样测定，在脑脊液中万古霉素的浓度为1673.2±813.8 ng/ml（均值±标准差），RSD为48.6%，美罗培南的浓度为80.3±62.8ng/ml，RSD为78.2%。

3. 讨论

据报道美罗培南在室温下易降解、稳定性差[7, 8]，经考察，在室温下放置1h后，盐酸万古霉素与美罗培南的质控样品检测结果均符合中国药典要求，表明样品在室温放置1 h稳定性良好（放置时间超过1 h，盐酸万古霉素含量保持稳定，美罗培南含量下降）。

在参与本文治疗药物监测的7例颅脑手术患者共计34份脑脊液样本中，一名患者脑脊液中万古霉素含量较低，经临床药师建议将万古霉素更换为利奈唑胺，进行治疗药物监测的7名患者手术后预后均良好。不同患者之间的美罗培南与万古霉素的浓度差异较大，可能是由于不同患者之间的病理生理状态差异所导致；在抗菌药物的用药过程中，个体差异会导致最佳用药量之前可能存在较大差异，为了确保患者能够得到最佳的治疗、避免不良反应的发生，有必要对此类患者开展治疗药物监测。

脑脊液中药物浓度的差异可能是由于不同患者之间的病理生理状态差异，或者是脑脊液漏液引起脑脊液总体积发生改变所导致。由于血脑屏障的存在，对脑脊液中的药物浓度进行测定更为直接，更能反映在用药过程中，患者与药物之间的相互作用，使临床药师能够更为准确的进行评估[9]。在IDSA所提出的《MRSA治疗指南》中，仅有万古霉素与美罗培南在人血浆中的推荐浓度范围，目前尚未存在有关抗菌药物在脑脊液中的推荐浓度范围的指南性参考，本文中所开展的TDM工作不仅确保患者能够得到最佳的治疗、避免不良反应的发生；同时，本实验中所测定的颅脑手术患者脑脊液中抗菌药物浓度范围，也能够为后续相关指南的制定提供一些参考。

4. 结论

本文所建立的LC-MS/MS法快速、灵敏、稳定，可应用于临床脑脊液样本的检测。通过对颅脑手术患者进行盐酸万古霉素和美罗培南的TDM，临床药师依据测定结果结合患者实际病理生理情况对给药方案进行调整，保证临床疗效的同时减少了不良反应的发生。

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