海南森祺制药有限公司
摘要:目的:使用HPLC方法准确测定出胆木浸膏胶囊中异长春花苷内酰胺的含量,方法:采用高效液相色谱法,采用外标法以Ultimate XB-C18(4.6x250mm,5μm)为色谱柱,流动相为乙腈-水-磷酸(35:65:0.1),检测波长:226nm,柱温:30℃,流速为1.0ml/min,进样量20μl。结果:建立了胆木浸膏胶囊中异长春花苷内酰胺的HPLC含量测定方法,线性范围为:4.99μg/ml~99.74μg/ml,回收率为100.9%,RSD为0.5%。结论:经过验证确定该方法稳定、可靠、专属性强可用于胆木浸膏胶囊异长春花苷内酰胺含量测定。
胆木浸膏胶囊能够起到消炎止痛和清热解毒的功效,可用于治疗急性的扁桃体炎和急性的咽炎,对于急性的结膜炎以及上呼吸道出现感染的情况也有很好的缓解作用。
1、实验材料
仪器 高效液相色谱仪(赛默飞 Ultimate3000);电子天平(赛多利斯CPA225D)
样品与试剂 胆木浸膏胶囊(海南森琪制药有限公司提供);异长春花苷内酰胺对照品(中国食品药品检定研究院);乙腈(上海星可高纯溶剂有限公司)
2、方法
色谱条件:采用外标法以Ultimate XB-C18(4.6x250mm,5μm)为色谱柱,流动相为乙腈-水-磷酸(35:65:0.1),检测波长:226nm,柱温:30℃,流速为1.0ml/min,进样量20μl。
溶液配制:对照品溶液
精密称取异长春花苷内酰胺对照品约10mg,置200ml容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,即得。
供试品溶液
取供试品10粒,倾出内容物并混匀,精密称取本品约0.1g,置50ml容量瓶中,加甲醇适量,超声处理(功率150W,频率40kHz)30min,放冷,用甲醇定容至刻度,摇匀,滤过,精密量取滤液2ml置于10ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,用0.45μm的有机滤膜滤过,取续滤液,即得。取空白溶液、供试品溶液与对照品溶液分别量取20μl注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算。
3、验证
系统适用性(专属性)
系统适用性(专属性)检测结果:
空白辅料溶液 | 空白辅料溶液中各辅料峰,均不干扰异长春花苷内酰胺含量的检出 | |
样品 | 保留时间(min) | 峰面积 |
对照品溶液1-1 | 5.06 | 2590.57 |
对照品溶液1-2 | 5.06 | 2591.56 |
对照品溶液1-3 | 5.06 | 2596.19 |
对照品溶液1-4 | 5.06 | 2594.53 |
对照品溶液1-5 | 5.06 | 2597.53 |
平均值 | 5.06 | 2594.08 |
RSD | 0.1% | 0.1% |
(2)结果评价:
根据系统适用性(专属性)检测结果汇总,空白辅料溶液中辅料峰,均不干扰异长春花苷内酰胺含量的检出;对照品溶液连续进样5次,异长春花苷内酰胺保留时间RSD值为0.1%、峰面积RSD为0.1%,专属性强。
耐用性
(1)耐用性检测结果:
耐用性研究项目 | 条件 | 含量(mg/ml) | 相对平均偏差 |
流动相比例 | 40:60:0.1 | 2.3 | 2.1% |
35:65:0.1 | 2.4 | N/A | |
30:70:0.1 | 2.4 | 0.0% | |
磷酸浓度 | 0.08 | 2.3 | 2.1% |
0.1 | 2.4 | N/A | |
0.12 | 2.3 | 2.1% | |
流速 | 0.9ml/min | 2.3 | 2.1% |
1.0ml/min | 2.4 | N/A | |
1.1ml/min | 2.3 | 2.1% | |
柱温 | 25℃ | 2.4 | 0.0% |
30℃ | 2.4 | N/A | |
35℃ | 2.4 | 0.0% | |
色谱柱 | InertSustain C18 ,4.6*250mm,5μm | 2.4 | N/A |
Ultimate XB-C18 ,4.6*250mm,5μm | 2.4 | 0.0% | |
波长 | 224nm | 2.4 | 0.0% |
226nm | 2.4 | N/A | |
228nm | 2.4 | 0.0% |
(2)结果评价:
根据耐用性检测结果汇总,各个条件下异长春花苷内酰胺峰与其他组分峰的分离度均≥1.5,分离度较好;理论塔板数均大于5000,测得样品含量与原始条件的相对平均偏差均小于5.0%,,符合耐用性要求。
精密度
重复性试验
重复性试验检测结果:
名称 | M对(mg) | 峰面积 | 峰面积平均值 | 峰面积RSD | 回收率 | |
对照品溶液1-1 | 10.58 | 2666.67 | 2677.92 | 0.4% | 99.5% | |
对照品溶液1-2 | 2678.31 | |||||
对照品溶液1-3 | 2692.47 | |||||
对照品溶液1-4 | 2682.08 | |||||
对照品溶液1-5 | 2670.08 | |||||
对照品溶液2 | 10.63 | 2678.17 | N/A | N/A | ||
序号 | M样(g) | 峰面积 | 相对密度 | 含量(mg/ml) | 平均值 | RSD |
供试品1 | 1.28543 | 998.74 | 1.28 | 2.42 | 2.4 | 1.1% |
供试品2 | 1.28365 | 1004.79 | 2.43 | |||
供试品3 | 1.28150 | 991.85 | 2.41 | |||
供试品4 | 1.29107 | 991.08 | 2.39 | |||
供试品5 | 1.29126 | 992.03 | 2.39 | |||
供试品6 | 1.29896 | 985.31 | 2.36 |
(2)结果评价:
重复性试验检测结果汇总,6份样品测得的异长春花苷内酰胺含量平均值为2.4mg/ml,其含量RSD值为:1.1%,重复性良好。
中间精密度试验
中间精密度试验检测结果:
名称 | M对(mg) | 峰面积 | 峰面积平均值 | 峰面积RSD | 回收率 | |
对照品溶液1-1 | 10.65 | 2767.59 | 2775.38 | 0.2% | 100.1% | |
对照品溶液1-2 | 2779.00 | |||||
对照品溶液1-3 | 2773.85 | |||||
对照品溶液1-4 | 2775.51 | |||||
对照品溶液1-5 | 2780.93 | |||||
对照品溶液2 | 10.56 | 2755.62 | N/A | N/A | ||
序号 | M样(g) | 峰面积 | 相对密度 | 含量(mg/ml) | 平均值 | RSD |
供试品1 | 1.29640 | 1088.76 | 1.28 | 2.54 | 2.5 | 2.8% |
供试品2 | 1.29718 | 1057.79 | 2.46 | |||
供试品3 | 1.29245 | 1134.65 | 2.65 | |||
供试品4 | 1.28126 | 1063.76 | 2.51 | |||
供试品5 | 1.28971 | 1063.29 | 2.49 | |||
供试品6 | 1.28831 | 1051.82 | 2.47 |
(2)重复性与中间精密度RSD(12份样品)
重复性与中间精密度实验数据汇总结果(N=12) | |||||||
名称 | 样1 | 样2 | 样3 | 样4 | 样5 | 样6 | 平均值 |
检验员1 | 2.42 | 2.43 | 2.41 | 2.39 | 2.39 | 2.36 | 2.40 |
检验员2 | 2.54 | 2.46 | 2.65 | 2.51 | 2.49 | 2.47 | 2.52 |
平均值 | 2.5 | ||||||
RSD | 3.3% |
(3)结果评价:
中间精密度试验检测结果汇总,6份样品测得的异长春花苷内酰胺含量平均值为2.5mg/ml,其含量RSD值为2.8%;两人所得12份异长春花苷内酰胺的含量RSD为3.3%;中间精密度良好。
线性与范围
检测结果:
线性浓度 | 10% | 25% | 50% | 100% | 150% | 200% |
浓度(μg/ml) | 4.99 | 12.47 | 24.93 | 49.87 | 74.80 | 99.74 |
峰面积A | 258.01 | 647.42 | 1294.40 | 2620.01 | 3922.42 | 5278.16 |
100%理论浓度(μg/ml) | 50 | |||||
截距与100%响应值比(%) | 0.30 | |||||
相关系数 | 1.0000 | |||||
线性方程 | y=52.569x-7.9812 |
(2)结果评价:
根据线性与范围检测结果汇总,异长春花苷内酰胺含量在4.99μg/ml~99.74μg/ml的相关系数r为1.0000,两者的截距b均在100%响应值的2%以内,线性良好。
检测限与定量限
检测限与定量限检测结果:
检测限与定量限 | |||||||||
名称 | 定量限 | 检测限 | |||||||
浓度(μg/ml) | 0.15 | 0.05 | |||||||
信噪比 | 14.9 | 4.8 | |||||||
定量限进样精密度 | |||||||||
名称 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD(%) | |
峰面积 | 7.62 | 7.69 | 7.54 | 7.70 | 7.54 | 7.52 | 7.60 | 1.1 | |
峰高 | 0.993 | 0.993 | 0.984 | 0.998 | 0.981 | 0.990 | 0.990 | 0.6 | |
信噪比 | 15.4 | 15.7 | 15.3 | 15.5 | 15.9 | 14.9 | 15 | 2.3 | |
信噪比(S/N) | |||||||||
名称 | 1 | 2 | 3 | 平均值 | |||||
检测限 | 4.7 | 4.7 | 4.5 | 5 | |||||
(2)结果评价:
根据检测限与定量限检测结果汇总,异长春花苷内酰胺检测限与定量限的浓度分别为0.05μg/ml、0.15μg/ml均低于限度;异长春花苷内酰胺定量限的信噪比为14.9、检测限的信噪比为4.8;定量限浓度下的溶液连续进样6次,异长春花苷内酰胺的峰面积的RSD为1.1%;两者检测限浓度下溶液连续进样3次,信噪比均大于3。
1.1.准确度
(1)回收率检测结果:
加标浓度 | 本底(μg/ml) | 实测值(μg/ml) | 理论值(μg/ml) | 回收率(%) | 平均回收率(%)(n=9) | RSD(%)(n=9) |
25% | 15.41 | 27.16 | 11.70 | 100.43 | 100.9 | 0.5 |
15.31 | 27.02 | 100.09 | ||||
15.27 | 27.08 | 100.94 | ||||
50% | 15.18 | 38.76 | 23.40 | 100.77 | ||
15.16 | 38.69 | 100.56 | ||||
15.01 | 38.66 | 101.07 | ||||
100% | 15.28 | 62.57 | 46.80 | 101.05 | ||
15.16 | 62.69 | 101.56 | ||||
15.14 | 62.68 | 101.58 | ||||
可接受标准:各浓度下的回收率均在90.0%~108.0%,RSD≤10.0%(n=9)。 |
(2)结果评价:
根据准确度试验检测结果汇总,各浓度下异长春花苷内酰胺的回收率为100.9%,回收率RSD为0.5%,准确度良好。
稳定性试验
(1)稳定性试验检测结果:
名称 | 时间点(小时) | 峰面积 | 变化值 |
对照品溶液 | 0 | 2740.60 | 0.0% |
2 | 2766.53 | 0.9% | |
4 | 2787.40 | 1.7% | |
8 | 2835.02 | 3.4% | |
12 | 2878.71 | 5.0% | |
24 | 3039.31 | 10.9% | |
供试品溶液 | 0 | 987.42 | 0.0% |
2 | 989.54 | 0.2% | |
4 | 994.53 | 0.7% | |
8 | 1003.92 | 1.7% | |
12 | 1016.25 | 2.9% 74 | |
24 | 1052.47 | 6.6% |
(2)结果评价:
根据稳定性试验检测结果汇总,对照品溶液与供试品溶液的异长春花苷内酰胺峰面积在12小时内变化值≤5.0%,说明对照品溶液与供试品溶液在12小时内稳定,故后期配制样品到进样需在12小时内完成。
经过对该HPLC方法的分析方法验证,该分析方法系统适用性(专属性)、耐用性、检测限与定量限、线性与范围、溶液稳定性、准确度、精密度等项目都符合要求,结果表明该方法可以准确检测出胆木浸膏胶囊中异长春花苷内酰胺的含量。
参考文献:
[1]王思寰,吴越,王玉,等.药品分析方法验证要点的讨论[J].药物分析杂志,2018(9):1646-1651.
[2][1]周光耀,余黛媚,张怡.基于HPLC方法测定预灌封注射器组合件中丙烯酸浸出量[J].广州化工,2023(18):62-64.