分子互作在体外诊断试剂原材料评价中的应用

分子互作在体外诊断试剂原材料评价中的应用

朱小林  梁永羿  林 骏  刘 尧  纪 元通讯作者

深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）                 深圳518057

[摘要] 体外诊断试剂作为医学诊断领域的重要组成部分，其检测准确性和稳定性直接关系到临床诊疗的效果。在体外诊断试剂的生产和研发过程中，以抗原、抗体为代表原材料的质量评价是至关重要的一环。分子相互作用作为物质间的基本作用之一，在体外诊断试剂蛋白类原材料质量评价中发挥日益重要的作用。本文对生物膜干涉法（BLI）等分子相互作用的常用技术及原理进行概述，旨在分析分子相互作用在体外诊断试剂原材料质量评价中的具体应用和重要性，为加强体外诊断试剂质量监管提供新思路。

[关键词] 分子相互作用；生物膜干涉法(BLI)；体外诊断试剂原材料；抗原抗体亲和力

引言：

随着医疗科技的飞速发展，体外诊断试剂在疾病的预防、诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用。其中，抗原、抗体等蛋白类原材料作为体外诊断试剂的上游核心组成部分，其质量直接决定了下游诊断试剂产品的准确性和稳定性[1]。例如，检测用抗体则能够识别并结合患者样本中特异性抗原，并做定性及定量检测。蛋白类原材料的质量和纯度是影响体外诊断试剂准确性和可靠性的关键因素，如果所使用的蛋白类原材料存在质量问题，可能会产生假性结果导致诊断结果不准确，给患者带来不必要的困扰和风险[2]。因此，对体外诊断试剂蛋白类原材料进行质量评价，可以提高诊断的准确性和可靠性。这对于疾病的早期诊断、治疗和预防具有重要意义。

分子相互作用是影响试剂灵敏度的关键因素之一。当试剂接触目标分析物时，它们之间的相互作用力决定了它们能否形成稳定的复合物，是试剂检测目标分析物的基础。分子间的相互作用力越强，试剂就与目标分析物形成的复合物越稳定，并可最终形成检测数据[3]。在体外诊断试剂蛋白类原材料中，抗原与抗体的结合能力直接决定了原材料的优劣，引入分子相互作用可以更全面的描述原材料的检测功能，保障体外诊断试剂的最终质量。

1. 体外诊断试剂蛋白类原材料质量评价的意义

体外诊断试剂在现代医疗领域发挥着至关重要的作用，它们为临床诊断、治疗以及预防疾病提供了重要依据[1]。随着体外诊断市场的不断扩大，对试剂的性能和质量要求也越来越高。而蛋白类原材料作为体外诊断试剂的核心成分，其质量直接影响体外诊断试剂的准确性和可靠性，进而影响诊断试剂的整体性能。高质量的蛋白类原材料是保障诊断试剂高敏感性和高特异性的根本，而质量不合格的蛋白类原材料可能导致诊断试剂出现假阳性或假阴性的结果，不仅会给患者带来不必要的恐慌和困扰，还可能误导医生诊断，对患者的健康造成潜在的威胁[4]。因此，对体外诊断试剂蛋白类原材料进行质量评价，能够确保所使用的原材料符合相关标准，降低诊断风险，保障患者安全。

目前，许多国家和地区都制定了严格的体外诊断试剂监管法规和标准，要求体外诊断试剂必须经过严格的质量评价才能上市销售。但我国与发达国家在体外诊断原材料的质量标准建设方面仍有差距，尚未形成严格的监管法规及标准；导致我国体外诊断试剂原材料质量鱼龙混杂，对国产原料的市场化应用造成了极大的阻力。现有的体外诊断试剂原材料质量评价多集中于材料的结构及纯度等性质，未能对其功能性进行完整评价。因此，引入分子相互作用等方式测定蛋白类原材料功能性将成为检测及提升蛋白类原材料品质的重要手段。

2. 常用分子相互作用测定方法及原理

除常用的酶联免疫法等确定分子相互作用情况外，还应从生物物理学角度对分子间相互作用及作用力大小进行分析，其结果可作为原材料质量评价的重要指标。本文综述了常用生物物理学的分子相互作用检测方法，并简要介绍其优缺点。

2.1荧光共振能量转移

FRET是一种基于荧光技术的分子相互作用测定方法。其原理是当两个荧光分子（缀合荧光的供体bait 蛋白及受体prey 蛋白）距离足够近时，供体分子在激发态时可以将能量传递给受体分子，导致受体分子发出荧光。通过分析荧光信号的变化研究分子间的相互作用。该方法具有高灵敏度、高特异性等优点，可检测特定的亚细胞组分来研究蛋白相互作用的动力学。FRET显微镜技术已成为检测体内蛋白直接结合的相互作用的有力手段，但需要特定的荧光标记和复杂的实验设备。

2.2核磁共振

NMR技术基于原子核（通常是氢核）在磁场中的自旋和磁矩特性。当原子核处于强磁场中时，它们会沿着磁场方向排列，并在受到特定频率的射频辐射时发生共振，从而吸收能量并跃迁到高能级。当射频辐射停止后，原子核会释放能量并返回到低能级，同时释放出特定频率的电磁波。这些电磁波被检测器接收并转化为信号，用于分析分子结构和分子间的相互作用。通过分析NMR谱图中的信号变化和峰位移动等信息，可以推断出分子间的结合方式、结合位点和结合强度等[5]。NMR可以实现无标记检测分子相互作用，但是仪器价格较为昂贵，检测通量比较低，不适合作为原材料质量评价的首选手段。

2.3微量热泳动技术

MST是一种基于热泳动现象的分析方法，用于定量研究生物分子间的相互作用。其基本原理为，当生物分子处于微观的温度梯度场中时，分子会受到热泳动力的作用而发生定向移动。这种热泳动力的大小与分子的质量、电荷、水化层以及构象等多种因素有关。当生物分子间发生相互作用时，这些性质可能会发生变化，从而影响分子在温度梯度场中的运动状态。通过红外激光加热样品，在样品中产生一个微观的温度梯度场。同时，将其中一个互作分子（如蛋白质）标记上荧光染料或融合GFP标签，以便于通过荧光信号监测分子的运动状态。MST仪器通过记录和分析这些荧光信号的变化，可以定量评估生物分子间的相互作用。但其检测建立在荧光标记基础上，应用范围较为狭窄。

2.4表面等离子共振

SPR是一种基于光学原理的分子相互作用测定方法。其原理是在金属表面形成一层等离子波，当偏振光以特定的角度入射到棱镜与金属膜的界面时，会发生全反射。光产生的消逝波与金属表面的自由电子产生共振，即表面等离子波。当生物分子与金属表面结合会引起等离子波的变化，导致传感器表面折射率增加，改变其共振角，进而产生可检测的信号，通过软件检测处理信号可形成最终分析结果[6]。该方法具有高灵敏度、实时监测等优点，无需标签修饰。但需要昂贵的实验设备和复杂的实验操作。

2.5生物膜干涉技术

BLI是一种基于光学原理的分子相互作用技术，监测生物分子之间的相互作用以评估其质量和性能。通过光纤生物传感器来实时检测分子结合与解离时传感器光学层厚度的变化。当蛋白质分子结合到传感器末端时，会形成一层生物膜，待检测的蛋白质分子与其发生相互作用时，会引起传感器末端分子量的改变，从而导致生物膜厚度的变化。通过实时监测干涉光谱的变化。BLI技术可以分析蛋白质间的相互作用，进而评估蛋白质原材料的质量。该技术应用广泛，可以实时、无标记地检测生物分子间的结合与解离过程，从而提供关于蛋白质纯度、亲和力、动力学参数等关键信息[7]。因在BLI实验中，需要将配体（如抗体、受体等）固定到传感器尖端表面，这可能会对配体的活性和稳定性产生一定的影响。虽然BLI技术具有较高的灵敏度，但与表面等离子共振、SPR相比可能稍逊一筹。这可能会限制其在某些需要极高灵敏度检测中的应用。

3. 分子相互作用在体外诊断试剂原材料质量评价中的应用

虽然上述几种分子相互作用检测方式均可以进行蛋白质分子相互作用的研究：但原理各异，检测的侧重点有所不同。其中NMR是最重要的无标记的分子结构和分子间作用方式检测手段，其结果可作为检测未知蛋白类原材料分子间作用的新标准。但其通量偏低，无法实时监测生物分子间的相互作用。而利用MST和FRET测定方式需要依赖于荧光标记，在原材料质量评价中引入了新的物质，容易对原材料本身的检测性质产生影响[8]。因此，BLI和SPR技术可以作为原材料质量评价中的关键一环，以确定分子相互作用性质及检测分子相互作用力（亲和力）。这两种技术可以通过实时监测生物分子间的相互作用，提供蛋白质亲和力和动力学参数等数据，有助于了解蛋白质功能及与其他分子的相互作用关系。

蛋白质与其配体之间的亲和力反映了它们之间结合的紧密程度。在体外诊断试剂中，蛋白质通常作为识别分子，与特定的配体（如抗原、抗体或其他生物标志物）结合，以实现疾病的检测或诊断。因此，准确评估蛋白质与配体之间的亲和力对于确保诊断试剂的准确性和可靠性至关重要。高亲和力的蛋白质能够更有效地与配体结合，提高诊断试剂的灵敏度和特异性。通过测量蛋白质与其配体之间的亲和力以及动力学参数，如结合常数（ka或kon）和解离常数（kd或koff），了解不同诊断试剂原材料结合活力与功能性的差异[13，14]。尤其在体外诊断试剂原材料的生产过程中，测量蛋白质与其配体之间的亲和力以及动力学参数可以用于质量控制和风险评估。通过定期监测这些参数的变化，及时发现生产问题并采取相应的纠正措施，以提升产品质量。

4. 展望

除上述提及的检测方式外，还有一些新兴的技术也被用于分子相互作用的研究，如双分子荧光互补（BiFC）、荧光相关光谱（FCS）等[8]。这些方法在某些特定场景下可能具有更高的准确性和灵敏度，但也需要更多的实验条件和技术支持。结合其他结构生物学技术，如X射线晶体学、核磁共振等，分子相互作用技术可以进一步用于解析抗原抗体复合物的结构，深入理解抗体与靶标之间的相互作用机制，为检测原材料优化提供重要指导。通过测量蛋白质与其配体之间的亲和力以及动力学参数，可以对原材料的质量进行全面评价。这有助于筛选出具有优异性能的原材料，提高诊断试剂的整体质量。

此外，随着人工智能（AI）技术的发展，生物信息学技术及AI在检测用抗原抗体原材料及抗体药物研发中的应用也日益广泛。可以用于抗体结构设计、纳米抗体库设计等方面。这些技术的应用可以大大提高新原材料研发的效率和准确性，保障原材料质量。同时，这些数据还可以用于制定更严格的原材料质量标准，确保产品符合预期的性能要求，助力体外诊断试剂行业市场监管，提升行业质量。

参考文献

[1]高倩,江洪,陈禹保.我国体外诊断行业发展现状与对策建议[J].中国生物工程杂志,2022,42(10):105-111.DOI:10.13523/j.cb.2205022.

[2]林新文,廖晓棠,海乐,等.体外诊断试剂生产质量管理要点研究[J].中国医学工程,2022,30(08):58-62.DOI:10.19338/j.issn.1672-2019.2022.08.012.

[3]郑少秋,李一昊,王娅,等.临床前生物技术药物诱导免疫复合物的形成机制及检测方法研究进展[J].药物评价研究,2022,45(04):788-795.

[4]吴丹,李平,鄢峰.体外诊断试剂临床试验存在的问题与分析[J].分子诊断与治疗杂志,2023,15(05):905-908.DOI:10.19930/j.cnki.jmdt.2023.05.018.

[5]聂瑶.蛋白质与配体相互作用的核磁共振波谱研究[D].中国科学院大学(中国科学院武汉物理与数学研究所),2020.DOI:10.27602/d.cnki.gkwws.2020.000002.

[6]胡馨儿,戚敏钰,张颖,等.表面等离子共振传感器在生物分子检测中的应用进展[J/OL].沈阳药科大学学报:1-13[2024-05-06].https://doi.org/10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2022.1184.

[7]张艳,姜丽艳,张晓光,等.生物膜干涉技术在生物分子间相互作用检测中的应用[J].生命科学仪器,2019,17(02):49-52+42.

[8]王倩,王静,宋书香,等.微量热泳动技术在生物分子相互作用研究中的应用（英文）[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences,2020,29(09):656-665.

基金项目：

2023年度十大科研课题；项目名称：体外诊断试剂蛋白类原材料制备、质量评价方法及标准研究，深圳市药品检验研究院，项目编号：YNKT20230106

2022年科技创新项目；项目名称：体外诊断试剂抗原抗体原材料质量评价方法及标准研究科技创新团队，广东省药品监督管理局，项目编号：2022TDB54