基于金纳米花双信号适配体传感器的中药材真菌毒素检测研究

基于金纳米花双信号适配体传感器的中药材真菌毒素检测研究

王晓希 白婧

（山东协和学院 山东·济南 250109）

摘要：目的真菌毒素污染是中药外源性有害残留物污染的重要因素，其污染的隐蔽性和危害性严重影响中药的品质与安全。随着中药全产业链中真菌毒素安全控制要求的不断提高，现场快速检测技术在真菌毒素分析领域愈加重要；方法基于金纳米花双信号适配体传感器的中药材真菌毒素赭曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉烯酮（ZEN）检测，以金纳米花为载体，将含OTA和ZEN适配体的单链DNA共价交联在金纳米花表面，进一步将其与两种荧光染料（FAM和Cy3）标记的互补DNA杂交，制备DNA功能化纳米探针。荧光染料和金纳米花之间发生荧光共振能量转移（FRET）导致纳米探针自身无荧光。加入OTA和ZEN后，FAM和Cy3从探针表面脱落会扰乱FRET过程，导致两者荧光的恢复，可以实现基于荧光“关-开”的方式同时检测OTA和ZEN；结果 制备高灵敏度的双信号荧光传感器的用于OTA和ZEN检测;双信号荧光适配体传感器对OTA检测的线性范围为0.05ng·mL-1-500ng·mL-1，检出限为0.017ng·mL-1。对ZEN检测的线性范围为0.1ng·mL-1-500ng·mL-1，检出限为0.033ng·mL-1；验证双信号荧光传感器对于OTA、ZEN具有良好的选择性和抗干扰性；结论制备高灵敏度的双信号荧光传感器的用于OTA和ZEN检测，该传感器对其他真菌毒素的抗干扰能力强、精确度高。

关键词：金纳米花；双信号适配体；生物传感器；真菌毒素检测

据世界卫生组织的相关调查显示，世界上每年有25％左右的中药植物受到真菌毒素的污染，2％的中药因污染严重而失去营养和经济价值，造成的经济损失高达数千亿美元。因此，建立简便、准确、高效、快速检测真菌毒素的方法迫在眉睫。适配体不仅拥有高选择性、高灵敏度、高亲和力和强特异性，还具有可重复使用、易于合成和修饰、稳定性优良、和成本低廉等优点。但当前构建的适配体传感器多为单信号响应性，仅能通过单一信号的变化达成对真菌毒素的检测，在实际样品检测中抗干扰性、重现性和分辨率较差，还有待进一步优化和开发。本研究以开发适用于真菌毒素的简便、灵敏、快速、实时、现场定量的检测方法为出发点，结合适配体和双信号响应传感器的优势，构建双信号响应型适配体传感器用于真菌毒素的检测。探针吸光度比值和荧光强度的变化与真菌毒素浓度存在线性关系，借此建立和完善真菌毒素的分析方法。该检测方法无复杂的前处理，检测速度快，选择性及灵敏度强，不仅对减少中药经济损失、保障人体健康具有重要意义，同时可以为中药安全评估体系建立准确、可靠的真菌毒素检测标准提供科学依据。

1材料与方法

1.1实验材料

Ph计、涡旋混合器、超声波清洗器、电子分析天平、荧光分光光度计、纳米粒度分析仪、台式高速冷冻离心机、紫外可见光分光光度计、双功能数显恒温振荡器、数显集热式恒温加热磁力搅拌器、巯基聚乙二醇、无水乙醇、柠檬酸三钠、盐酸羟胺、盐酸多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮、双（对－磺酸苯基）苯基膦、磷酸盐缓冲溶液、DNA片段。

1.2实验方法

首先，将过量的双(对-磺酸苯基)苯基膦(BSPP)加入1mLAuFL(制备方法见2.2.7)溶液中，并在室温下孵育过夜。纯化步骤后，将得到的BSPP修饰的AuFL与5μLR1(100μM)和5μLR2(100μM)一起混合,并在室温下震荡24h。然后,加入5μL0.2mM巯基聚乙二醇，在室温下反应60min来阻断粒子的非特异性结合位点。离心水洗后,重分散在1mL的PBS(pH7.4)缓冲溶液中,加入5μLF1(100μM)和5μLF2(100μM),并在37°C下孵育6h进行DNA互补杂交。最后，通过离心，洗涤去除未键合的DNA，制得DNA功能化的纳米探针，将其重新分散在1mLPBS(pH7.4)缓冲液中,并在4°C冰箱中储存备用。

2结果与分析

2.2 OTA和ZEN同时检测的原理

R1和R2为修饰有巯基的单链DNA，且部分序列可互补杂交（黑色部分），不互补的部分分别含特异性识别OTA（绿色部分）和ZEN（红色部分）的适配体。F1和F2为与OTA适配体和ZEN适配体互补的单链DNA，且分别修饰有荧光染料FAM和Cy3，作为FRET过程的两个不同的能量供体。首先，制备了AuFL作为能量受体，通过Au-s键将R1和R2组装在AuFL表面。然后，加入互补链F1和F2进行碱基互补配对，将Ｈ和F2组装到AuFL表面形成DNA功能化纳米探针。适配体和互补链之间的杂交反应使两种荧光染料（FAM和Cy3）和AuFL之间距离足够接近，引起供体向受体的能量转移。因此，由于FRET的发生，导致FAM和Cy3荧光的猝灭，纳米探针溶液自身无荧光。当加入OTA后，OTA和R1上的适配体特异性结合，R1-F1双链发生解离，导致修饰有FAM的F1从探针上脱落和FRET过程的中断，518nm处FAM的荧光（得到恢复。当加入ZEN后，ZEN和R2上的适配体特异性结合，R2-F2双链发生解离，导致修饰有Cy3的F2从探针上脱落和FRET过程的中断，570nm处Cy3的荧光得到恢复。因此，通过利用两个供体和单个受体的双信号FRET和靶标诱导的荧光恢复，可以实现基于荧光“关－开”方式同时检测OTA和ZEN。基于AuFL的双荧光信号对OTA和ZEN同时检测的原理图如图1所示。

图1 基于AuFL的双荧光信号对OTA和ZEN同时检测的原理图

2.2双信号荧光传感器的检测条件优化

对OTA和ZEN与双信号荧光传感器之间的反应时间和反应体系PH进行条件优化，双信号荧光传感器识别目标物的最佳反应时间为3min，最佳Ph为7.4。在优化后的实验条件下，得出荧光强度与OTA、ZEN浓度对数的线性范围和检测限，双信号荧光适配体传感器对OTA检测的线性范围为0.05ng·mL-1-500ng·mL-1，检出限为0.017ng·mL-1。对ZEN检测的线性范围为0.1ng·mL-1-500ng·mL-1，检出限为0.033ng·mL-1；验证双信号荧光传感器对于OTA、ZEN具有良好的选择性和抗干扰性

2.3双信号荧光传感器的选择性测试

选择性是适配体传感器的一项重要指标。为探究双信号荧光传感器的选择性，将FBI、AFB和OTB作为干扰因素进行研究。通过比较空白，即使FBI、AFB和OTB的干扰浓度（5ug·ml-1）远高于OTA浓度（100ng·ml-1），双信号荧光传感器的荧光强度响应值并未发生明显变化，当OTA加入后，FAM荧光强度响应值发生十分明显的上升，说明该双信号荧光传感器对于OTA具有良好的选择性和抗干扰性，能够实现OTA的特异性检测；当ZEN加入后，Cy3荧光强度响应值发生十分明显的上升，说明该双信号荧光传感器对于ZEN具有良好的选择性和抗干扰性，能够实现ZEN的特异性检测。

3结论

本实验基于AuFL供体和两种荧光染料受体之间的FRET机理，构建了一种双信号荧光适配体传感器用于OTA和ZEN的检测。该传感器对OTA和ZEN检测具有高灵敏度、选择性和准确性，可通过显著的荧光变化进行定量分析。这种基于双荧光信号响应构建的适配体传感器在真菌毒素的同时检测方面具有巨大潜力。

参考文献

[1]俞静,姚志豪,何开雨,等.基于纳米材料的光学生物传感器在中药真菌毒素检测中的应用[J].分析化学,2023,51(04):472-488.

[2]方鹏,王帅,毛瑜,等.基于靶标诱导滚环扩增的无标记适配体生物传感器快速检测赭曲霉毒素A[J].食品研究与开发,2024,45(03):174-180.

发表论文来源：全国大学生生命科学竞赛(2024,创新创业类)项目“基于金纳米花双信号适配体传感器的中药材真菌毒素检测研究”成果。

作者简介：王晓希(2004.10一)，女，山东协和学院本科生，专业：医学检验技术，研究方向：生物化学检验。

白婧（通讯作者）(1985.11一)，女，硕士研究生，山东协和学院医学院讲师，研究方向：医学检验技术。