浅谈GB/T5009.199-2003有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量在蔬菜快速检测中出现假阳性的应对措施

浅谈GB/T5009.199-2003有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量在蔬菜快速检测中出现假阳性的应对措施

王达岭

海南省儋州市农产品质量安全检验检测站  海南儋州  571700

摘要：GB/T5009.199-2003快速检测法作为我国农药残留检测的主要检测方法，具有成本低、省时，易操作、环境要求低的优点，广泛使用于我国蔬菜农药残留检测，为相关农产品监管中快速地了解农产品存在的主要安全问题，保障人们的食用农产品安全；但该方法在检测蔬菜过程中会出现假阳性问题，本文主要讲述检测蔬菜出现假阳性时，采取应对的措施，提高检测的准确性。

关键词：GB/T5009.199-2003；蔬菜；农药残留；假阳性

GB/T5009.199-2003快速检测技术具有操作简单和成本低的优点，在节省资源的基础上还具有良好的检测效果，其做出的检测效果不会受到时间和地点的影响，环境适应性非常强。在食用农产品安全监管中运用快速检测技术，可以帮助农产品质量安全检验检测部门就农产品中存在的安全问题快速把握，并及时解决，防止农药残留超标的蔬菜流入市场流入餐桌，从而侵害人民群众的健康。

1 农药的种类

1.1 有机磷农药

有机磷农药特点是使用较广泛，多数易氧化、水解、异构化。有机磷农药引起中毒的作用机理是抑制人体内的胆碱酯酶，使其失去分解乙酞胆碱的能力，导致人体内乙酞胆碱的不断积累，进而刺激中枢神经系统，使身体各项功能失调，引发生理紊乱。因此，对蔬菜中有机磷农药残留的检测是特别重要的。有机磷农药属于除草剂的一种，同时也具有一定的杀虫能力。有机磷农药通常会被应用在水果、蔬菜等农产品的种植过程中，在我国农业生产过程中占比居多。有机磷农药的分解性较好，但是其化学性质的稳定性较差。将其应用在农产品的生产过程中，很容易出现药物残留问题，而且有机磷农药的使用量过大也会对人类的生命安全产生直接影响。为了有效的解决有机磷农药残留问题，可以对酶抑制快速检测技术进行充分利用，此种方法能够对有机磷农药中的胆碱酯酶活性进行有效抑制，从而对农产品上的农药残留量进行有效检测。但是在运用此项技术进行检测时，其灵敏程度还存在不足，同时还需要对其回收率进行提升。在运用此方法进行检测时，可以使用速测卡检测法和酶液比色法对有机磷农药的残留物质进行检测。首先，速测卡检测法，胆碱酯酶主要是固化处理过程中存在的物质，在对农药残留进行检测时，需要将其放在专业的在提升，通过胆碱酯酶的进一步作用，可以让靛酚乙酸醋在短时间内被分解，最终形成胆碱以及乙酸。在使用此项检测技术时，其特点便是能够将检测时间控制在一定范围内，而且检测速度也比其他检测方法快，检测成本较低，操作简洁明了。但是使用速测卡进行检测也会存在缺陷，会因植物汁液中的次生物质而影响检测结果，而且由于时间与温度的不断变化也会使农药残留物检测结果出现差异。其次，酶液比色检测法，这种检测方法是通过与胆碱酯酶的相互作用，而出现较为明显的抑制效果。在一定条件下，能够使抑制作用和农药的浓度呈现正比关系。利用光度计进行吸光度检测，能够根据时间变化确定抑制程度的有效性。与酶液比色法相比，利用此种方法进行检测时，不会对农产品的蛋白质和水分产生影响，也不用对其进行分离处理，从而有效的提升农药残留物的检测效率，为农药残留物的研究工作提供有力支持。

1.2 氨基甲酸酯类农药

氨基甲酸酯类农药毒作用机理与有机磷农药类似，主要使胆碱酯酶中丝氨酸的羟基被氨基甲酰化，失去对乙酞胆碱的水解能力，从而抑制胆碱酯酶活性。氨基甲酸酯类农药不需经代谢活化，即可直接与胆碱酯酶形成疏松的复合体。由于氨基甲酸酯类农药与胆碱酯酶结合是可逆的，且在机体内很快被水解，胆碱酯酶活性较易恢复，故其毒性作用较有机磷农药中毒为轻。但多数氨基甲酸酯类农药，在施用后不长时间内就会被降解为相应的代谢产物，其代谢产物通常具有与母体氨基甲酸酯类农药相同或更强的生物活性。氨基甲酸酯类农药可经呼吸道、消化道侵入机体，也可经皮肤粘膜缓慢吸收，主要分布在肝、肾、脂肪和肌肉组织中。由氨基甲酸酯类除草剂的作用机理主要是选择性抑制植物的蛋白质合成，干扰细胞的有丝分裂，从而使杂草死亡，其毒性较低，不易引起人、畜中毒。氨基甲酸酯类杀虫剂对害虫的作用机理是抑制胆碱酯酶的活性，阻断正常神经传导，引起整个生理生化过程的失调，使害虫中毒死亡，具有内吸、触杀、胃毒作用。其作用机理与有机磷杀虫剂相类似，但也有不同，有机磷杀虫剂对胆碱酯酶的抑制是不可逆的，而氨基甲酸酯类杀虫剂对胆碱酯酶的抑制是可逆的。不同结构类型的品种的防治对象及毒性差别也很大，多数品种如异丙威、仲丁威、混灭威、速灭威等的毒性低，由于分子结构接近天然有机物，在自然界中易被分解，残留量低；少数品种如克百威、涕灭威等毒性高。氨基甲酸酯类农药可经消化道、呼吸道和皮肤黏膜进入体内，其中毒的机制主要是抑制神经组织、红细胞及血浆内的乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱酯酶被氨基甲酰化后失去对乙酰胆碱的水解能力，造成体内乙酰胆碱大量蓄积引起急性中毒。中毒者的主要症状有头晕、头痛、乏力、视力模糊、恶心、呕吐、流涎、多汗、瞳孔缩小等，有的可伴有肌束震颤等烟碱样症状，严重者可出现肺水肿、脑水肿或昏迷。此可见，对蔬菜中氨基甲酸酯类农药的检测也是必不可少的。

有机磷和氨基甲酸酯类几乎可以涵盖日常农药种类，适用广泛，同时检测样品过多，进行筛查检控的初期，酶抑制率法也是高效快速的方法，适用于市场的需求。酶抑制率法的主要优点可以总结为快速、灵敏、操作简便、成本低廉。快速的优势在于可以在很短的时间内得到检测结果，已成为对果蔬中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行现场快速定性初筛检测的主流技术之一，得到了越来越广泛的应用。便于监管单位或市场有关部门大量抽查果蔬等农产品和及时获取检测结果，从而更有效的进行监管监督，预防食品安全事故；灵敏是该方法检测准确度高，用于初筛准确率较高；操作简便是该方法用到了农药残留检测仪上之后，操作变得更加简单，使用门槛更低了，即使专业化程度不高的人员，也可以通过学习掌握果蔬农残的快速检测方法，自主进行检查监督；成本低廉在于，与精密的实验室检测方式相比，使用该方法检测成本低廉，大、中、小企业都有条件应用，从而使农药残留检测仪可以很快的普及使用，有效确保农产品的质量安全。 基于酶抑制率法的农药残留检测仪很好的继承了这种检测方法的优点，而且由于仪器便于携带，操作简单，方便进行现场检测，因此无论是在实验室中，还是在农贸市场、超市、食堂、种植基地，都可以利用仪器方便、快速的进行农产品农残检测，从采购源头、检测环节、销售环节等全渠道严格把控商品质量，真正守护农产品安全，为确保食品安全，给顾客提供放心、安全的食品，提供了重要保障。

2检测方法

2.1 检测原理

在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关，正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判所出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

2.2 提取液制作方法

选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，取样品2 g，放人烧杯或提取瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振荡1 min～2 min，倒出提取液，静置3min～5min，待用。

2.3提取液区别假阳性的3种处理方法

2.3.1离心

将提取液倒入15 mL离心管中，转移到离心机中，5000 r/min离心5 min，然后取上清液2.5 mL，再加人0.1 mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值△At1。

2.3.2使用有机滤膜，13 mm×0.22 μm过滤

将提取液倒入15 mL分别多次倒入2.5mL一次性针管中，过有机滤膜，13 mm×0.22 μm，使烧杯收集过滤液，然后取过滤液2.5 mL，再加人0.1mL酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37 ℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值△At2。

2.3.3使用含900 mg无水硫酸镁、150 mgPSA及45 mgGCB净化管

对于色素多的待测液，使用含900 mg无水硫酸镁、150 mgPSA及45 mgGCB净化管，涡旋1 min，转移到离心机中，5000 r/min离心5 min，然后取上清液2.5mL，再加人0.1 mL酶液、0.1 mL显色剂，摇匀后于37℃放置15 min以上（每批样品的控制时间应一致）。加入0.1 mL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值△At3。

3提取液假阳性测试

3.1对照溶液测试

先于试管中加入2.5 mL缓冲溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37℃放置16 min。加入0.1 mL底物摇匀，此时检测液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3min的吸光度变化值△A0。

3.2提取液测试

先于试管中加入2.5 mL提取液以及3种区别假阳性的处理提取液，其他操作与对照液测试过程相同，记录反应3 min的吸光度变化值△At0。

4 结果计算及结果判断

4.1 结果计算

抑制率（%）=[（△A0-△At）/△A0]×100

式中：

△A0—对照溶液反应3min的吸光度变化值；

△At—提取液以及3种处理后的提取液反应3min的吸光度变化值。

4.2 结果判定

结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示，当提取液对酶的抑制率≥50%且3个处理后的提取液对酶的抑制率≤50%时，表示蔬菜样品的提取液检测结果出现了假阳性。通过比较△At0、△At1、△At2、△At3得出，样品检测结果是否出现了假阳性，还能筛选出排除对提取液浑浊或色素过多造成假阳性的最优处理方法，从而提高检测的准确性。除了以上是针对提取蔬菜中有机磷、氨基甲酸酯类农药中的提取液的处理外，还要注意在农残的快速检测操作过程，可能出现“假阳性”结果，对此主要使用下列四种方式进行处理：

（1）复核整体检测过程，检测员需要结合检测过程，检查空白对照值的精准性，抑制率为检测值、空白对照值之间的比率，因此，空白对照值是影响检测结果的关键因素。当结果中出现多数样品呈“阳性”时，此时需要核对对照值的真实性，提升检查结果准确度。与此同时，对检查过程的取样流程、方法、有效性等进行核对。当取样过程方法不当时，也会造成上述结果。例如：部分蔬菜韭菜、香葱、香菜等自身对酶活性影响较大，在检测上述农产品时，可先将整株进行浸泡，防止浸泡液流出，导致检测结果出现“假阳性”，为检测结果的判定提供依据，保证整个检测过程完全符合农残快检的操作规范，规避检测中的结果风险。

（2）重点落实检测环节反应温度的一致性检查，由于农残快检过程温度对酶稳定性、活性等影响程度较高。如果冬季检测，实验室中可能温度条件难以恒定，可在“水浴锅”内完成10 min的酶反应；在夏季检测时，由于室温过高可能抑制酶的活性，因此，可选择上午时间将试剂配制好，保证验过程处于恒温环境中进行。在具体实践过程，为提高检测成功率，需要全面检查反应全程温度是否恒定，落实空白对照组设计，保证检测结果的精准性。

（3）检查酶受到抑制的反应时间，整个检测过程，由于酶抑制时间的不同对检测结果以及结果利用等有重要影响。当酶受抑制时间较长时，其抑制率也会提高。当待检样品中加入底物之后未迅速置于比色池当中，就会将酶的反应时间延长，导致结果中有多个抑制率值呈“假阳性”。对此，为保证检测过程侧科学性，高效实施检测计划，需要保障对照组、检测组等酶抑制的反应时间相一致。

（4）处理无效数值问题。检测环节，检测结果中存在负值，主要因为检测过程吸光值比对照检测吸光值高，导致系统出现错误。此时，需要重新进行对照试验，检测环节中检测人员需要严格对移液枪的使用作出规范，保证农残检验流程规范，提高结果精度。

在检测过程，比色池当中产生个别无数值的通道，针对这一问题，检测人员主要可对检测仪进行检查，对紫外光灯的工作状态全面检查，确认其是否存在故障。同时，还需对酶、显色剂等添加情况展开全方位检查，为检测环节提供精准的参考信息。对以上无效数值的处理可保证后续检测流程顺利进行，处理上述问题时，相关人员需要重点积累检测经验，不断提高农残快检工作水平。

5结 语

总而言之，在农残快检过程，要根据具体情况，确认是提取农药过程产生的问题，还是使用仪器操作的问题，需要依靠完善的检测流程，针对检测环节存在的各类问题，要找出影响因素，采取针对性解决措施，提高检测结果的准确性，保证结果的高效利用。同时，农药种类逐渐多样化，要求检测技术不断发展，将检测流程进一步优化，对此需要相关技术人员深入思考，全面分析检测过程的影响因素，运用先进的技术加以解决，提高检测结果质量和精度。

参考文献

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[2]周达彪．果蔬中有机磷类农药速测技术的研究与应用［J］．长江蔬菜，2008（2）：44-45．

[3]林瑾，陈越．蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测［J］．广东化工，2011,38（7）：228．