MDCK悬浮细胞驯化之培养基筛选方法

MDCK悬浮细胞驯化之培养基筛选方法

兰嘉桐  姜天  任新颖  张嵘*

辽宁科瑟生物技术有限公司 110000；沈阳药科大学 110016

摘要：目的：将贴壁型MDCK细胞驯化为悬浮培养型。方法：MDCK细胞悬浮培养的无血清培养基，驯化MDCK悬浮细胞。结果：驯化方法简便，驯化MDCK贴壁型细胞进行无血清悬浮培养，周期短，成本低，细胞生长迅速且状态良好。结论：成功驯化MDCK悬浮细胞系，为疫苗生产研究提供理论支持。

关键词：MDCK细胞；流行流感；细胞悬浮培养；无血清培养基；

前言：MDCK细胞是流感疫苗研究和生产的主要介质，但其传统的贴壁生长方式在工艺放大和成本方面存在挑战，给研究带来不便。因此，将贴壁型MDCK细胞驯化为悬浮培养型，用于病毒感染以生产流感疫苗，为制造安全、有效且质量可控的疫苗提供了坚实基础。

1 材料和方法

1.1 细胞株

实验室所涉及细胞株为贴壁细胞系（美国ATCC，CCL-3）犬肾上皮细胞，批号70040764，viability 94％、VCD 2.4*106cells/mL。采用软琼脂实验法筛选获得克隆性率最低的MDCK细胞。

1.2 试剂

MEM基础培养基：从美国Gibco公司购买，使用超纯水配制并过滤除菌，分装后4 ℃冷藏保存。使用时添加20％或10％胎牛血清（（FBS,Fetal Bovine Serum）（批号：202314100）购自太原润生生物公司）。

MDCK培养基：包括MDCK 626培养基、MDCK SFM培养基和MDCK细胞无血清培养基，分别从GORNING、天信和生物科技及上海倍谙基生物公司购买，配制后过滤除菌并冷藏保存。

0.25％胰蛋白酶和EDTA：从美国Gibco和Sigma公司购买，配制后过滤除菌，分装并冷冻保存。

碳酸氢钠：从国药集团化学试剂有限公司购买，配制后过滤除菌，分装并常温保存。

台盼蓝染色液：从福州飞净生物科技有限公司购买，使用时稀释。

1.3 设备与耗材

生物安全柜：青岛海尔生物医疗股份有限公司，型号HR30-IA2。

二氧化碳培养箱：山东博科科学仪器有限公司，型号QP-160。

倒置生物显微镜：重庆光电技术有限公司，型号DSZ2000X。

细胞荧光计数仪：上海睿钰生物科技有限公司，型号Counistar Mira FL。

低速台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号TDZ-WS。

二氧化碳恒温摇床：苏州捷美电子有限公司，型号IS-5C5。

细胞培养瓶：康宁生命科学(吴江)有限公司，规格T25、T75。

细胞三角培养摇瓶：康宁生命科学(吴江)有限公司，规格125 mL、250 mL、500 mL、1000 mL。

无菌移液管：比克曼生物公司，规格1 mL、5 mL、10 mL。

无菌离心管：规格10 mL。

1.4MDCK细胞无血清培养液培养驯化

 MDCK细胞复苏：从单克隆实验中筛选出的MDCK细胞（F11），首先在含20%胎牛血清的MEM培养液中培养，次日更换为含10%胎牛血清的MEM培养液，并传代至T75规格培养瓶。

细胞处理：当细胞生长至单层90%时，去除培养液，使用胰蛋白酶和EDTA消化，再用MEM培养液终止消化，离心收集细胞。

悬浮驯化培养：将细胞分别用MDCK SFM、MDCK 626和MDCK无血清培养液重悬，转移至125 mL三角摇瓶中，标记为F11A、F11B、F11C，进行悬浮驯化培养。

连续传代：在二氧化碳恒温摇床中培养3天后，离心重悬，依次传代至250 mL、500 mL和1000 mL三角摇瓶中，继续悬浮驯化。

细胞计数：每间隔一天取样，使用台盼蓝染色后进行细胞计数。

1.5 台盼蓝染色细胞计数法

将稀释的台盼蓝染色液与细胞悬液1:1混合均匀，转移至细胞计数板，细胞计数仪下检测，得活细胞数、总细胞数、活率、直径、接团率等数据。

1.6MDCK细胞冻存

对MDCK细胞冻存，取样细胞计数，收集细胞悬浮混合液于离心管中，1600 rpm/min离心10 min，弃上悬液，加入冻存液（MDCK细胞无血清悬浮培养基+9％DMSO）重悬，以每管1-1.2 mL细胞重悬液分至冻存管，并做好细胞名称、代次、编号、冻存时间等标记。将冻存管置于4 ℃冰箱放置2 h，后转至-20 ℃冰箱放2 h，再置于-70 ℃超低温冰箱过夜，最终将冻存管放至液氮罐中长期保存，做好冻存记录。

2 结果

2.1 MDCK细胞无血清培养液培养驯化

MDCK悬浮驯化期间，培养时间每间隔1 d，对使用3种不同类型非含血清培养基的摇瓶取样计数，最终得出生长曲线图。比较可知，相比于MDCK SFM培养基与SFM 626培养基，选用MDCK细胞无血清悬浮培养基进行悬浮培养驯化，细胞生长速率最快，VCD最高达1.14×107 cells/mL，细胞活率最高，viability最高达98％，由图1可知驯化后的悬浮培养型MDCK细胞呈大小均匀、透亮的圆形，生长状态好，直径约18.29 μm。

图1 驯化前后MDCK细胞生长形态对比（A：驯化前贴壁生长，B：驯化后悬浮生长）

3 讨论

MDCK细胞为分离出的依赖贴壁生长型细胞，是生产流感疫苗使用最多且最理想的介质，本研究利用“筛选无血清培养基”的直接驯化法，筛选出适宜悬浮型的MDCK无血清悬浮培养基（倍谙基），将贴壁培养型细胞系驯化为无血清悬浮培养型细胞株MDCK-F11，最终将新型悬浮培养型细胞株冻存，对流感疫苗实际工业化生产具有重大意义。

参考文献

[1] 阮朝列. MDCK细胞悬浮培养驯化及流感病毒培养研究[D].北京协和医学院,2023.

[2] 刘萍. MDCK细胞悬浮培养的驯化及在H9亚型禽流感疫苗的初步应用[D].甘肃农业大学,2020.

[10]贾涵婧. 用于流感疫苗生产的MDCK悬浮细胞流加培养工艺的开发[D].华东理工大学,2015.

作者简介：第一作者 兰嘉桐 1980.10.5 男 吉林省白山市 汉族 硕士 工程师 辽宁科瑟生物技术有限公司 研究方向: 疫苗研发与质量管理

第二作者 姜天 男 辽宁丹东 满族 硕士 辽宁科瑟生物技术有限公司 研究方向:疫苗研发

第三作者 任新颖 女 河北省邯郸市 汉

第四作者 张嵘 女 辽宁省沈阳市 汉