浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究

浓香型白酒特征风味关键酶的酶学特性研究

                                     杨智华

四川宜宾高洲酒业有限责任公司，四川宜宾 645150

摘  要：己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质，其合成的关键酶为酯酶，因此研究酯酶的特性对浓香型白酒具有重要的意义。以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究。

关键词：己酸乙酯；酯酶；白酒

己酸乙酯是浓香型白酒的主体香味物质[1]，如何提高原酒中己酸乙酯的含量，是解决浓香型白酒生产的瓶颈提高浓香型白酒质量的关键[2-7]。

3.1.1酯酶(Esterase，EC，.1)亦称羧基酯酶，是指可以水解羧酯键的酶，但该酶也能催化合成低级脂肪酸酯，由于该酶既能催化酯的合成，也能催化酯的分解，因此，白酒业习惯分别称为酯化酶和酯分解酶。

己酸和乙醇在酯化酶作用下合成己酸乙酯，是己酸乙酯合成的主要途径；酯酶主要是由大曲发酵过程中由微生物代谢产生的[8-11]。因此，对大曲中酯酶的分离纯化及酶学特性具有重要的意义。

本研究以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1酯酶的提取和纯化

(1)样品来源

浓香大曲由四川宜宾高洲酒业有限责任公司提供。

(2)试剂

己酸、无水乙醇，购于Sigma公司；冰冻离心机；751型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋；硫酸铵；0.lmol/L 磷酸钠缓冲液，pH7.0。

(3)仪器

蛋白分离纯化系统,瑞典GEAKTA purifier100；UV-2100型分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；数显恒温水浴锅，金坛市正基仪器有限公司；PB-10pH计，Sartorius公司；ALPHAI-5真空冷冻干燥仪,德国Christ公司；层析柱，上海华美实验仪器厂。

1.1.2酯酶特性研究

(1)试剂

乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸，色谱纯，Acros Organics。

(2)主要试验设备及仪器

气相色谱仪 PerkinElmer 配有FID捡测器。

2.2试验方法

2.2.1酯酶酶活力定义及测定方法

由于白酒发酵时间较长（在25天以上），大曲的用量较大（原料量10%左右/以上）；且在发酵过程中，以粗酶制剂（反应体系中原料、菌体、酶相互作用）的形式进行酶促反应的；发酵过程，酯酶作用温度在30℃左右；发酵过程中酒精浓度可达10%以上，相当于水溶液中乙醇浓度为15%左右。

30℃因此，为了更好的指导生产，将酯酶活力定义为：1mg酶制剂在模拟白酒发酵反应体系（1%己酸，15%无水乙醇，5%酯酶制剂，79%蒸馏水）中，酯化120h后，用气相色谱法测定反应体系中己酸乙酯的浓度，每生成1ppm己酸乙酯定义为1酶活力单位，用u表示。

2.2.2蛋白质含量测定

用考马斯亮兰G-250法测定不同提取及纯化阶段的蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。

2.2.3酯化率及相对酯化率

由于目前关于酶活的定义并不统一，因此在进行酶学特性研究时，以酯化率作为酶促反应进行的度量标准，同时为了更好的比较，引入相对酯化率。酯化率和相对酯化率定义如下：

酯化率=生成酯的摩尔量/添加酸的摩尔量*100%。

相对酯化率=各反应的酯化率/本次试验的最大酯化率，其中最大酯化率定义为100%。

2.2.4酯酶的分离纯化

(1)提取

4℃按大曲:水=1:5加入预先冷却的蒸馏水，在预冷的组织捣碎机中捣碎匀质，置于下浸提1h，用4层纱布过滤，滤液于15000rpm冷冻离心15min，取上清液。

(2)纯化

a.盐析：在冰浴中缓缓加入硫酸铵，使其最终浓度为80%，18000rpm冷冻离心，离心10min，弃去上清液；

4℃b.透析：复溶于pH为7.0的磷酸钠缓冲溶液，装入透析袋，下透析，直至无硫酸根离子析出为止（用BaCl2溶液检查）；

1.6cm20cmc.离子交换：透析完毕后，用DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析（Φ×），平衡缓冲液为pH为7.0的磷酸钠缓冲溶液，280nm下检测吸光值，取不同吸光值的流分；

d.判定：重复步骤a和步骤b，测定酶活，取目标组分，进行冷冻干燥，即得酯化酶。

2.2.5酯酶酶学特性研究

2.2.5.1酯酶对不同酸与乙醇酯化能力大小的研究（底物专一性）

30℃分别吸取乙酸、乳酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸各1mL于100mL锥形瓶中，加入15mL无水乙醇，分别加入酯化酶1mg，用蒸馏水将其定容到100mL，下酯化120h后，测定反应体系中各种酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。试验3个水平，取平均值。

2.2.5.2酯酶对白酒四大酸酯化的选择性（优先选择性）

30℃分别吸取乙酸、乳酸、丁酸、己酸各0.25ml于100mL锥形瓶中，加入15mL无水乙醇，分别加入酯化酶1mg，用蒸馏水将其定容到100mL，下酯化120h后，测定反应体系中各种酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。

2.2.5.3对于酯酶催化合成己酸乙酯随时间的变化情况

30℃吸取己酸1.0mL于100ml锥形瓶中，加入15mL无水乙醇，加入酯化酶1mg，用蒸馏水定容到100ml，分别置于下酯化，每隔24h测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。

2.2.5.4不同乙醇浓度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响

30℃分别吸取己酸1mL于100mL锥形瓶中，依次加入6、8、10、12、14、16、18、20、22mL无水乙醇，分别加入酯化酶1mg，用蒸馏水将其定容到100mL，下酯化120h后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。

2.2.5.5不同己酸浓度对酯酶催化合成己酸乙酯的影响

30℃分别吸取己酸0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于100ml锥形瓶中，加入15mL无水乙醇，分别加入酯化酶1mg，用蒸馏水将其定容到100mL，下酯化120h后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。

2.2.5.6温度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响

吸取己酸1.0mL于100mL锥形瓶中，加入15mL无水乙醇，加入酯化酶1mg，用蒸馏水定容到100ml，分别置于25、30、35、40、45℃下酯化120h后，测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率。做三次重复试验，取平均值。

2.2.5.7酯酶的热稳定性

85℃将酯酶接种到没有底物的反应体系中，分别置于45~下保持2min，加入反应底物，测定酯酶活力。做三次重复试验，取平均值。

2.2.6己酸酸乙酯测定方法

酯化后，将整个反应溶液倒入500ml的圆底烧瓶中，加入100ml 蒸馏水进行蒸馏，收集100ml馏分，用气相色谱测定其中己酸乙酯的含量。

气相色谱条件如下：

50m0.25mm毛细管柱：CP-WAX 57：×色谱柱

240℃260℃进样口温度：，检测器温度：，载气：氮气（1 ml /min）

30℃4℃60℃10℃130℃15℃205℃色谱柱升温程序：保温4 min，/ min升温至，/ min升到，/ min升温至保温15 min。

2 结果与分析

2.1酯酶纯化

大曲酯酶按本实验条件经匀质提取，过滤，硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换，透析和冷冻干燥后，得到纯化后的酯酶，相关指标见表1。从表1可以看出，酯酶的纯化倍数为32.21倍，酶活力回收率为36.19%。

表1 酯酶的分离纯化结果

2.2酶学特性研究

2.2.1酯酶对不同酸与乙醇酯化能力大小的研究（专一性）

在反应体系中分别单独加入不同种类的酸，加入酯化酶进行酯化反应，反应结束后测定酯化率和相对酯化率，结果见图1。

由试验结果可以看出，除乳酸外，酯酶对乙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸的酯化率随分子量的增大而逐渐增大，这可能因为乳酸的支链结构，阻碍了酯化过程。

图1 酯酶对白酒中不同酸类的相对酯化率

注：以酯化率最高的辛酸的酯化率为对照（相对酯化率100%），其它与其相比较，以下试验均取酯化率最高的作为对照。

2.2.2酯酶对白酒四大酸酯化的选择性（选择性）

在反应体系中添加与白酒四大酯对应的酸类物质，加入酯化酶进行酯化反应，反应结束后测定酯化率和相对酯化率，试验结果见图2。

图2 混合条件下酯酶对白酒中四大酯的相对催化率

从图2可以看出，在白酒四大酯类相对应的酸类物质乙酸、乳酸、丁酸、己酸同时存在的情况下，酯酶优先催化合成己酸乙酯，且相对酯化率要明显高于单独催化时的相对酯化率，这与大曲的试验结果一致。说明，在白酒发酵体系中，酯酶优先催化合成己酸乙酯，且催化合成以己酸乙酯为主。

而己酸乙酯又为浓香型白酒的特征风味，因此大曲中酯酶对与浓香型白酒己酸乙酯含量具有重要作用。因此，以下将结合浓香型白酒实际生产的工艺，重点研究浓香型大曲中酯酶对己酸的催化特性。

2.2.3时间对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响

在反应体系中加入己酸，加入浓香型大曲中提取的酯化酶进行酯化，于不同时间测定反应体系中己酸乙酯的含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图3。

从图3可以看出，在72h之前，酯化反应的速度是基本恒定的，72h以后，酯化速度随反应时间的延长而降低，120h后反应基本结束。因此取120h为以下研究的反应时间。

图3 酯化率随反应时间的变化情况

2.2.4不同乙醇浓度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响

为了进一步弄清乙醇对酯化反应的影响，改变反应体系中乙醇的浓度，进行酯化，酯化结束后，测定己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图4。

从图4可以看出，酯酶对己酸的酯化能力受乙醇的影响较大。在乙醇浓度为10%以下时，酯酶催化合成己酸乙酯的能力随乙醇浓度的增加而提高，这可能是由于乙醇浓度的提高致使底物浓度的提高，促使反应向酯化方向进行。当乙醇大于10%时，酯酶催化合成己酸乙酯的能力随乙醇浓度的增加而呈减少趋势，这一方面是由于底物浓度的饱和致使酯酶酯化反应速率趋于恒定，另一方面，随着乙醇浓度的增加，导致反应体系极性的变化，就导致酯酶空间结构的变化，从而使其催化活力降低。因此，在浓香型白酒酿造时，酒醅中乙醇浓度达到10%时，为控制己酸乙酯含量的重要控制点。

图4 不同酒精浓度下酯酶对己酸的相对酯化率

2.2.5不同己酸浓度对酯酶催化合成己酸乙酯的影响

为了进一步弄清乙酸对酯化反应的影响，改变反应体系中乙酸的浓度，进行酯化，酯化结束后，测定己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图5。

由试验结果可以看出，随己酸浓度的增加，酯酶催化合成己酸乙酯的量也呈先增加后减少的趋势，并不符合典型的米氏方程，最适宜的己酸浓度为1%。当己酸浓度大于1%时，酯酶催化合成己酸乙酯的含量随己酸量的增加呈逐渐减少趋势，这可能是由于在水溶液反应体系下，当己酸含量增加到一定程度后，将对酯酶的空间结构产生影响，从而对酯酶的活性产生抑制。

图5 不同己酸浓度下己酸乙酯相对酯化率

2.2.6温度对于酯酶催化合成己酸乙酯的影响

温度，是白酒酿造过程中一个很重要的控制指标。为了更好的通过控制温度来控制己酸乙酯含量，将酯化体系置于不同的温度下进行酯化，酯化结束后测定体系中己酸乙酯含量，并计算酯化率和相对酯化率，结果见图6。

图6 不同温度下己酸的相对酯化率

50℃40℃40℃60℃30℃从图6可以看出，酯化率随温度的变化呈近似的正态分布趋势，最适宜的催化温度在35~之间，以下时，反应速度随温度的升高而增加，以上时，反应速度随温度的升高而降低，在仍有23%的相对酯化率，在发酵过程中的酯化温度下，相对酯化率为58%。

3小结

以浓香型大曲为研究对象，对其中的酯化酶进行分离纯化，并对其酶学特性的研究，得到如下结论。

（1）对浓香型大曲中催化合成己酸乙酯的酯酶进行分离纯化，样品经匀质提取，过滤，硫酸铵盐析，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换，透析和冷冻干燥后，酶活纯化倍数为32.21倍，酶活保留率为36.19%。

（2）以浓香型大曲中酯酶为研究对象，与白酒生产实际相结合，研究了其酶学特性。包括，催化己酸和乙醇合成己酸乙酯随时间变化趋势，对酸类底物的专一性、优先选择性，底物浓度（乙醇浓度、乙酸浓度）对己酸酯化率的影响，以及温度对酯化率的影响。研究发现：

a.除乳酸外，酯化率随分子量的增大而逐渐增大，这可能与乳酸的结构有支链，阻碍了酯化过程。

b.在乙酸、乳酸、丁酸、己酸同时存在的情况下，酯化能力主要表现在己酸乙酯的酯化合成，说明酯化酶对浓香型白酒特征风味的生成具有关键作用。

c.在本试验条件下，在一定范围内，酯化酶对己酸乙酯的酯化率均随乙醇浓度和乙酸浓度增加而增加，超出一定的浓度范围则对酯化作用产生抑制，这可能是导致反应体系极性的变化从而导致酶活力中心结构的变化，进而影响酶的活力；在乙醇浓度为10%时，酯化率最大；在己酸浓度为1%（v/v）时，酯化率最大。

50℃d.不同催化温度和酶添加量对酯化酶催化合成己酸乙酯的影响。发现最适宜的酯酶添加量为5%，最适宜的催化温度为35~。

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