免疫组化双染技术在儿童淋巴瘤中的应用价值

免疫组化双染技术在儿童淋巴瘤中的应用价值

徐红艳  吴艳   黄慧  樊金星  曾松涛

江西省儿童医院  330006

关键词：免疫组化；双染技术；淋巴瘤

中图分类号：R733.4； 文献标志码：B

随着检测技术的不断改进，免疫组化在肿瘤的诊断中发挥着承前启后的作用：主要包括SP法、PAP法、ABC法等[1]。这些方法都常用来检测组织细胞中一种抗原成分，但单一的免疫组化提供组织信息有限，着色在2张或多张切片上，位置分离，如果要明确两种抗原在同一细胞或组织内的相互关系，需要不断的比对寻找肿瘤成分，加大了病理医师对结果判读的难度。应用T/B(CD3+CD20)和T/B(CD45RO+CD79a)淋巴细胞免疫组化双染技术，可以在同一张切片上清晰地显示两种特异性的抗原表达，诊断医师可以看清哪些是B淋巴细胞和T淋巴细胞；哪些是良性的反应性增生；哪些是恶性的肿瘤细胞，同时由于制片等客观因素的影响，肿瘤组织周边常出现一些裂隙，肉眼难以区分是否是真裂隙还是扩张的脉管，利用免疫组化双染技术-脉管标记物CD34和另一种已知的肿瘤细胞标记物双染，可以观察到明确的脉管内瘤栓，有利于对肿瘤的组织学结构判读和预后评估，减少误差。本文应用T/B淋巴细胞免疫组化双染技术，在同一张淋巴组织切片中检测T/B淋巴细胞肿瘤，取得了比较理想的结果，与免疫组化单一标记染色结果一致。

1  材料与方法

1.1  材料  收集江西省儿童医院病理科2023年～2024年存档的反应性增生淋巴结组织10例、淋巴瘤组织40例，标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚切片。一抗包括CD45RO（鼠抗人）、CD3（兔抗人）、CD20（鼠抗人）、CD79a（兔抗人）及免疫组化双染试剂盒，均购自北京中杉金桥有限公司。

1.2 方法 免疫组化双染操作步骤 （1）石蜡切片脱蜡至水。（2）高温高压抗原热修复，喷气后计时2min，自然冷却后水洗。（3）PBS（PH7.4）冲洗，3min×3次，除去PBS液，滴加50ul 3% H2O2溶液，室温孵育10min。（4）蒸馏水冲洗，3min×3次，PBS（pH7.4）冲洗，3min×3次。（5）滴加试剂1，即用型封闭液，湿盒孵育10min。（6）弃去液体，勿洗，加入足量一抗混合于切片上，湿盒孵育、过夜。（7）PBS（PH7.4）冲洗，3min×3次，除去PBS液，将两种二抗按照所需比例混合，充分混匀，37％湿盒孵育30min，PBS（pH7.4）冲洗，3min×3次。（8）滴加足以覆盖组织的DAB显色液，镜下显色3min，蒸馏水终止反应。（9）在每张切片上滴加足以覆盖组织的即配AP-Red工作液，镜下观察显色10min，蒸馏水冲洗，终止反应。（10）苏木精复染15s，自来水冲洗，PBS返蓝。（11）滴加足量的封片剂覆盖组织，使封片剂均匀平铺覆盖组织，水平放置切片，勿加盖玻片，37％烤箱中放置3h，直至完全变干[2]。

2  结果

所选择的淋巴组织中T淋巴细胞CD3阳性呈棕色，CD45RO阳性呈红色；B淋巴细胞 CD20阳性呈红色，CD79a 阳性呈棕色。经T/B（CD3+CD20）、T/B（CD45RO+CD79a）淋巴细胞免疫组化双染可以清晰地辨别出哪些是B淋巴细胞和T淋巴细胞，哪种细胞增生占明显的优势，恶性的肿瘤细胞是哪种细胞等，便于诊断医师判别淋巴瘤的类型。

3 讨论

免疫组化双染技术是一种改良而先进的免疫组化方法，它以不同的酶系统催化不同的显色底物呈现不同的颜色，在同一张切片显示两种不同抗原的表达[3]。目前，多采用间接-异种动物抗体法，即一抗分别由不同的动物产生，二抗也由不同动物针对相应一抗产生。应用该方法可以将不同的一抗和二抗混在一起使用，且彼此之间不会发生交叉反应，即节约了时间，还保证染色效果[4]。实验中对判读T/B细胞淋巴瘤就属于这种情况，因为分别使用了鼠和兔的一抗，二抗分别为抗鼠和抗兔，在寻找出4种抗体匹配的最佳稀释度的情况下双染一般不会有交叉反应或可控制在最低程度。应用双染技术可对细胞的种类，分化程度、表面抗原的特点进行更深入的研究。免疫组化双染技术可实现在同一切片上同时展现两种不同的抗原表达效果，弥补了单一染色的不足，特别是在穿刺标本中，还能最大限度地节约宝贵的组织样本，在儿童肿瘤的诊断中保证了灵敏度和特异性，使染色结果更直观、对比更明显、判读更准确。

综上所述，免疫组化双染技术就像一个连环扣，要把握好每一个操作步骤，才能确保免疫组化双染质量。应用免疫组化双重染色技术检测淋巴瘤组织学类型不仅具有灵敏和特异性，技术上也相对简单、实用，充分利用这种成熟而稳定的技术将给我们的工作和研究带来很大的帮助[5]。

参考文献

[1]刘洪博,刘艳彩,张新丽,侯素平,邱雷,张晓娟.免疫组化双染技术在淋巴瘤亚型检测中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(10):1174-1175.

[2]周航波,马恒辉,饶秋,周晓军.T/B(CD3+CD20)淋巴细胞免疫组化双染技术在淋巴瘤诊断中的应用[J].临床与实验病理学杂志,2011,27(2):209.

[3]滕孝静,王卫东,谢建兰,周小鸽.原位杂交与免疫组化双染法在淋巴瘤诊断中的应用[J].临床和实验医学杂志，2013,12（14）:1106-1107.

[4]沈洁,赵薇,毛利民,张宏颖.Ploymer双染检测技术在肿瘤研究中的应用及改进探讨[J].中国健康刊,2011,(8):251.

[5]范尔钟,李颖,王鸿,欧阳昱晖,王士杰,王阳.免疫细胞化学双染技术探讨[J].临床与实验病理学志,2011,27(10):1143-1144.