半薄切片技术对小麦种子早期发育细胞学形态的观察

半薄切片技术对小麦种子早期发育细胞学形态的观察

李柯碧1  柯可荣2

1吴川市乡村振兴服务中心 广东吴川 524500

  2吴川市振文镇农业技术服务中心 广东吴川 524500

摘  要

本研究收集成熟籽粒大小差异比较大的KN2007和SX828两品种的小麦，利用半薄切片手段对授粉1-7天的小麦观察。根据试验结果得出KN2007年授粉后的1-2天为游离核期，此时在胚囊壁的中央大液泡周围可以明显看出无细胞壁的细胞，并且某些细胞核内存在两个核仁。授粉后的3-7天则为细胞化期，其中第3天的胚乳细胞开始构建细胞壁，呈现出清晰的网状轮廓，直至第7天，胚乳细胞完全填充了整个胚乳囊；而SX828在授粉后1-5天为游离核期，授粉后的6-7天则进入细胞化期，但直至第7天，胚乳细胞尚未完全填充整个胚乳囊，未完成细胞建成期，这一发育速度相较于KN2007品种显得较为缓慢。此研究发现对认识小麦种子早期发育至关重要，同时也有利于进一步为小麦籽粒早期发育调控机制提供更多理论依据。

关键词：小麦；细胞化；半薄切片

目前关于小麦种子早期发育的分子机制报道较少，如细胞周期调控、DNA甲基化等事件会影响着小麦果皮与胚乳的发育。可能是因为早期果皮及胚乳细胞的细胞学观察报道较少，不便于科学家们分析表型来寻找其背后的分子机制，因此关于小麦籽粒发育早期的细胞学形态研究十分重要。

1材料与方法

1.1 试验材料

SX828与KN2007这两个品种的小麦，采用传统种植方法，在其开花时进行取材工作。在取材的时，选择要取材的小麦植株的标准是开花时间和生长状态一致，标记方法是记号笔点颖加单株挂牌，然后根据时间与记录，取符合要求的小麦籽粒，每次至少取10粒，要取的是授粉后1、2、3、4、5、6和 7d。

1.2 材料固定

1.2.1 固定液配制

根据本材料特性配制50%乙醇FAA固定液（50%乙醇、5%冰乙酸、3.7%甲醛）。并将其分装到准备好的若干10 mL EP 管中。

1.2.2 取材

准备取材料的尖头镊子。取对应天数与品种的小麦种子，用镊子将整个小麦种子取下，收集若干籽粒到已经准备好FAA固定液的EP管中。用封口膜封好已取材的EP管，平放在摇床上，摇床转速50-60 rpm，材料固定过夜（16-20小时），并储存于4 ℃冷室。

1.3 半薄切片的制作

1.3.1 脱水

两个品种1、2、3、4、5、6、7 d的各取2粒放入2 mL EP管中。然后从50%乙醇开始到100%乙醇结束，每10%为一梯度，各脱水1小时，100%乙醇再多处理1小时，100%乙醇+0.1 %(w/v)Eosin Y初染1小时。

1.3.2 孵育

样品换到100%乙醇/Technovit 7100摇床上孵育4小时每EP管0.5 mL 100%乙醇+ 0.5 mL Technovit 7100,摇床转速50-60 rpm）。

1.3.3 渗透

（1）渗透液准备。每100 mLTechnovit 7100加1 g Hardener I 充分混匀。每次按需要的量配置。

（2）渗透。样品换到渗透液中每个EP管1 mL渗透液,摇床渗透24小时。

1.3.4 包埋

（1）包埋准备。包埋前准备好烘片机，包埋板放在烘片机中央。包埋液准备：每15 mL渗透液中加入1 mL Hardener II平时配置可选择3 mL渗透液中加入200 μL的Hardener II充分混匀。

（2）包埋。将配置好的包埋液加入包埋孔中，每个孔中加入200 μL，将样品取出从EP管中取出将其放入包埋孔中，保证其在准确的位置。接着，烘片，烘片机设置的温度为40℃。然后用泡沫箱对其进行了保温处理，时间为2小时。然后等到包埋液基本凝固时，将其转移入40℃的烘箱，过夜，次日就可以达到切片标准。

1.3.5 切片的制作

（1）切片。莱卡超薄切片机切片3.5微米，切出的材料用镊子取下，提前在载玻片上滴加一滴超纯水，将材料放到超纯水上，利用水面张力将材料展平，然后轻轻吸掉多余的水使样品贴在载玻片上，然后用显微镜初步观察，将符合要求的材料用烘片机42℃烘干。重复上述操作，直到收集到本研究所需的样品。

（2）染色。配置0.25%甲苯胺蓝染色，为了防止有碎渣影响最后的结果，我们需要将配置好的染液进行过滤，得到纯净的染液才可以使用。染色时，染液加到上一步获得的有材料的载玻片上，时长2分钟，用超纯水漂洗载玻片，漂洗两遍，烘片机烘干。

（3）封片。中性树胶封片。

2结果与分析

2.1 切片技术优化

为了研究小麦籽粒发育的机制，通过切片技术去观察小麦早期发育的细胞生物学形态以及通过形态进一步探讨机制，根据实验室前期的结果与查阅文献本研究采用了效果更好的半薄切片。

在包埋与制片的过程中，如果没有将组织内的水分除尽，会对后续的孵育与渗透产生严重影响。因此延长了100%乙醇处理这一阶段的时间，将1小时延长为2小时。脱水完成后籽粒接近无色，切片时镜检不易观察展片情况，染色完成后才可发现问题，因此增加了100%乙醇+0.1 %（w/v）Eosin Y这一步对籽粒进行初染。

2.2 小麦籽粒显微结构观察

2.2.1 小麦籽粒横切面观察

观察不同品种小麦籽粒横切面的显微结构，观察细胞发育情况，结论：KN2007授粉后第1-4天的籽粒，果皮占比很大，果皮的厚度大约是籽粒横径的一半；授粉后5-7天果皮细胞开始退化，不断变薄。随着各种营养物质的积累，小麦籽粒的胚乳也在不断发育，从授粉后第4天开始，胚乳细胞开始占据胚乳囊，胚乳占胚乳囊的比例逐日增加；而SX828是授粉后1-5天果皮厚度约占籽粒横径的一半，从第6天胚乳细胞才明显充实。得出结论：SX828此品种发育速度慢于KN2007。

2.2.2 果皮显微结构观察

（1）KN2007果皮

授粉后第1天，可看到三层果皮结构，在各层果皮上可以发现已经有少量的淀粉粒开始积累，其中淀粉粒在中果皮中的积累相对较多，而外果皮上鲜有淀粉粒；授粉后第2天，淀粉粒明显增多，中果皮与内果皮尤为明显；授粉后第3天，大量的淀粉粒出现在中果皮薄壁细胞中，大小也明显增加，在内果皮中积累的淀粉粒同步增加，但外果皮中淀粉粒依然最少；授粉后第4-5天，通过观察小麦籽粒横切面，可以看到中果皮细胞结构开始不完整，很多细胞开始凋亡，而且果皮中积蓄的淀粉粒数量变化不明显；授粉后第6天，中果皮细胞大量凋亡很多淀粉粒已不在细胞结构内，淀粉粒数量也开始减少，外果皮变化不明显；授粉后第7天，中表皮已基本丧失细胞结构，也无淀粉粒，仅靠近外表皮内表皮的部位有游离的淀粉粒，淀粉粒积聚在内表皮内外，外表皮结构稳定负责维持小麦种子形态稳定。

（2）SX828果皮

授粉后第1天，在各层果皮上可以发现已经有少量的淀粉粒开始积累,其中淀粉粒在中果皮中的积累相对较多，内果皮中数量次之，外果皮数量最少；授粉后第2天，淀粉粒明显增多，中果皮与内果皮中淀粉粒积累增多尤为明显；授粉后第3-4天，大量的淀粉粒出现在中果皮薄壁细胞中，淀粉粒的大小明显增加，在内果皮中积累的淀粉粒也同步增加，但外果皮中淀粉粒依然最少；授粉后第5-6天，内果皮外层很多细胞开始凋亡，但中果皮中积蓄的淀粉粒数量变化不明显；授粉后第7天，内果皮细胞大量凋亡很多淀粉粒已不在细胞结构内，淀粉粒数量也开始减少，中果皮外果皮变化不明显，与KN2007相比，授粉后第7天，未出现中果皮丧失细胞结构，无淀粉粒的情况，仅内果皮发生细胞凋亡，外果皮内果皮结构变化不大。

3.2.3 胚乳显微结构观察

（1）KN2007胚乳细胞建成期。KN2007年授粉后的1-2天被确定为游离核期，此时在胚囊壁的中央大液泡周围可以明显看出无细胞壁的细胞，并且某些细胞核内存在两个核仁。授粉后的3-7天则为细胞化期，其中第3天的胚乳细胞开始构建细胞壁，呈现出清晰的网状轮廓，直至第7天，胚乳细胞完全填充了整个胚乳囊。

（2）SX828胚乳细胞建成期。SX828在授粉后1-5天被确定为游离核期，这一阶段在胚囊壁的中央大液泡周围可以清晰地观察到无细胞壁的细胞，部分细胞核内还存在两个核仁。授粉后的6-7天则进入细胞化期，其中第6天的胚乳细胞开始构建细胞壁，胚乳细胞在胚乳囊中逐渐出现，但直至第7天，胚乳细胞尚未完全填充整个胚乳囊。这一发育速度相较于KN2007品种显得较为缓慢，这与通过观察果皮中淀粉粒的出现和减少所做出的发育判断相一致。

3结论

3.1 果皮淀粉粒积累特征

小麦籽粒成熟过程中，果皮和胚乳的发育紧密相关。以KN2007品种为例，授粉后1天，果皮开始积累淀粉粒，到了第3天淀粉粒数量达到顶峰，随后逐渐减少。此外，在授粉后的第3天，果皮厚度达到最大，而第4天，果皮薄壁细胞开始凋亡，第7天显著退化。相比之下，SX828品种发育较慢，授粉后的第2天开始在果皮中积累淀粉粒，第4天淀粉粒数量和体积达到高峰，随后从第5天开始果皮逐渐分解，尽管如此，第7天时，仍然存在大量结构完整的果皮细胞。

3.2 胚乳发育和果皮淀粉积累的关系

小麦籽粒的生长发育伴随着胚乳发育和淀粉积累。查阅文献可知在授粉后第4-5天时，小麦籽粒胚乳细胞开始进入细胞化期，授粉第7天后结束细胞建成期进入细胞发育期。KN2007胚乳细胞在第3天开始发育，到达第7天时胚乳细胞已占据整个胚乳囊，其淀粉粒数量变化与之对应；SX828发育慢于KN2007，其胚乳细胞是在第5天结束了游离核期进入了细胞化期，胚乳细胞开始形成细胞壁。

在授粉早期，小麦籽粒的果皮中开始储存积累淀粉粒，我们跟据观察结果得出结论：这样做地目的是为之后的籽粒发育提供营养。再之后，经过一段时间地积累，小麦籽粒果皮中淀粉粒数量到达最多，并且在内果皮、中果皮、外果皮中的分布也大不相同，这一时期果皮中淀粉粒数量最多，与胚乳细胞开始发生增殖和分化的时期基本一致，我们跟据观察结果得出结论：这些淀粉粒为之后的细胞建成期提供了物质与能量。最后前面果皮中积累的淀粉粒都会被分解为胚乳细胞完成细胞发育期所需的营养物质。

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