RNA测序技术分析EV71感染肠道上皮细胞后外泌体中靶基因的转录组特征

RNA测序技术分析EV71感染肠道上皮细胞后外泌体中靶基因的转录组特征

杨爱平，张国华，杨明秀

上海市松江区九亭医院检验科，上海，201615

摘要 目的 通过RNA测序分析肠道病毒71型(EV71) 感染肠道上皮细胞(NCM460)后外泌体中差异表达的microRNA( miRNA)及其靶基因。方法 超速离心法提取细胞培养液上清外泌体，利用TargetScan和miRDB两个数据库病毒感染后同时上调或下调的miRNA靶基因进行预测，对上调和下调表达的靶基因进行GO和pathway分析，筛选与免疫应答相关的靶基因及其对应的miRNA。挑选部分miRNA和靶基因进行qRT-PCR验证。 结果 上调miRNA对应的靶基因有476个，下调miRNA对应的靶基因有962个；参与免疫应答相关GO及pathway的上调靶基因分别是12个和9个，对应的miRNA分别是11个和13个；参与免疫应答相关GO及pathway的下调靶基因分别是43个和39个，对应的miRNA分别是21个和35个。将参与免疫应答相关GO和pathway的上调或下调靶基因取交集，得到的靶基因分别有3个或9个，对应调控的miRNA分别有4个或13个。结论 本研究有助于阐明 EV71感染后致病机制，并为手足口病的发病机制研究提供参考。

关键词 肠道病毒71型；微小RNA；靶基因；外泌体

肠道病毒71型(enterovirus 71 ,EV71)是引起婴幼儿手足口病（HFMD）主要病原体之一，由4种结构蛋白(VP1 ~ VP4)和7种非结构蛋白(2A - 2C ,3A - 3D)构成,核苷酸同源性高达77%[1]。临床上，EV71感染以发热、咳嗽等呼吸道感染症状为主，常可导致严重或致死性的神经系统并发症[1，2]。外泌体（exosomes）是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为 30-150 nm的具有脂质双层膜的微小囊泡[3]。它广泛存在并分布于各种体液中，携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关[4]。本研究对 EV71感染的致病机制进行探究，以期为治疗EV71感染以及靶向抗EV71药物的开发提供新的思路。目前研究表明，肠道上皮细胞源外泌体中miRNAs在病毒感染性疾病的致病过程中也有十分重要的作用，宿主细胞编码的miRNAs对抗病毒感染的同时，病毒自身的结构蛋白或者非结构蛋白也会调控宿主miRNAs的表达来实现诸如免疫逃逸等多种病理生理过程[3]。基于上述背景，本研究对感染EV71后的肠道上皮细胞外泌体中miRNAs表达进行高通量测序以及生物信息学分析。

材料和方法

1、肠道上皮细胞(NCM460) 购于青旗（上海）生物技术发展有限公司，在37℃，5% CO2 孵箱中培养，培养基为1640基础培养基（E2103），添加1%双抗(青霉素和链霉素)和10%胎牛血清(GIBCO，美国)的DMEM高糖培养基 (GIBCO，美国)。将每孔1×105 个16HBE细胞置于6孔板中过夜培养，待细胞生长至80%融合后接种EV71(亚基因型C4，GenBank:EU812515 )。感染复数( MOI)为0. 01。在感染后0 h、12 h和24 h收集细胞，以0 h感染EV71的细胞作为对照。根据感染时间本研究分为3组 : EV71-0 h、EV71-12 h、EV71-24 h。使用 EV71-0 h 进行归一化(归一化值设为 1) ，设为对照。每组收集3批样本，分别合并后送往上海生工生物工程中心进行总RNA提取。

2、外泌体提取及鉴定 根据实验室操作规程采用超高速离心法提取EV71感染肠道上皮细胞(NCM460)上清液中外泌体，按外泌磁珠法（赛默飞世尔科技中国）试剂盒操作步骤纯化外泌体(批号：GW4869)，采用NTA分析（Nanoparticle Tracking Analysis）技术鉴定外泌体纯度

3、RNA提取与质量控制：使用mirVanaTM  miRNA分离试剂盒( Ambion，美国)从每组细胞中提取miRNA。miRNeasy试剂盒(Qiagen，德国)进一步纯化miRNA。安捷伦2100生物分析仪(安捷伦技术，美国)毛细管电泳检测RNA浓度和RNA完整性， RNA完整性数( RIN) > 7的样本用于miRNA谱分析。

4、miRNA文库制备、高通量测序和miRNA-seq数据分析：将纯化后的RNA进行接头序列的连接, 包括3′端的羟基团和5′端的磷酸基团，将连接好接头序列的RNA 进行反转录、PCR扩增、cDNA文库大小选择、纯化等步骤，完成测序样本文库构建。

5、miRNA 高通量测序结果分析：在得到的归一化数据中筛选出具有2倍差异性的miRNA。将EV71感染后表达趋势相同的miRNA作为后续研究的重点对象。对筛选出来的miRNA的靶基因使用TargetScan和miRDB两个数据库进行预测。将预测靶基因作为GO分析的对象，从而分析靶基因相关的功能改变情况。

6、差异性miRNA和靶基因的实时荧光定量RT- PCR( qRT-PCR)验证：选择4个差异表达的miRNA和4个靶基因进行qRT-PCR验证。以GAPDH为内参，以感染前样本作为处理前样本，各个时间点的样本作为处理后样本利用相对定量的计算方法2-△△Ct法计算各个基因在各个时间点相对表达量。qRT-PCR 中使用的 miRNA 特异性5′引物。

6、Western blot试验:向冻存于-80℃的细胞沉淀中加入1 ml RAPI 裂解液(含PMSF) ,充分混匀置于冰上30 min，4℃条件下12000 r/min离心5 min，取上清采用BCA 法测定总蛋白质浓度，每孔上样总蛋

结    果

1．EV71感染NCM460细胞后同时上调和同时下调的miRNA靶基因预测: 结果发现在两个数据库中都上调的miRNA靶基因为476个，在两个数据库中都下调的 miRNA靶基因为962个(表1)。为提高预测数据的可靠性，将上调和下调miRNA 的靶基因取交集，剔除同时出现在上调和下调数据里的基因（图1）。

表1 EV71感染NCM460细胞后上调和下调的miRNA靶基因预测

TargeScan与miRDB预测的共同上调靶基因598

1图 同时受上调以及下调miRNA调控的靶基因的剔除

2、EV71感染中与免疫相关的GO和pathway所涉及的miRNA及其靶基因分析：EV71感染结果发现在两个数据库中都上调的miRNA靶基因为476个，在两个数据库中都下调的miRNA靶基因为962个。在上调靶基因参与的与免疫应答相关的GO中筛选出了12个靶基因，对应的miRNA有9个；在上调靶基因参与免疫应答相关的path- way中筛选出了11个，对应的 miRNA有13个。在下调靶基因参与免疫应答相关的GO中筛选出了35个靶基因，对应的 miRNA有21个。

3、同时参与免疫相关的GO和pathway的miRNA及其靶基因分析：通过上述分析本研究初步筛选出了EV71感染参与免疫应答相关的靶基因和miRNA，但是得出的数据量依然比较大，为了进一步聚焦EV71感染中参与免疫相关的最重要靶基因和miRNA，进一步对上述数据进行聚焦。通过对参与免疫应答相关的GO和pathway对应的上调的靶基因取交集，得到的靶基因有3个，对应调控它们的miRNA有4个；另外，对免疫应答相关的GO和pathway对应的下调的靶基因取交集，得到的靶基因有9个，对应调控它们的miRNA有13个。这些 miRNA与靶基因将是我们后续进行分子机制研究的重要线索。

4、重点miRNA和靶基因的验证：为了验证高通量测序数据的准确性，在miRNA 中挑选let-7i-3p、miR-629-3p等进行验证，在靶基因中挑选CCL22、STAT4、MAPK14、 GADD45A等进行mRNA 水平的验证（表2、表3）。结果发现4 个miRNA都与高通量测序结果的变化趋势一致，8个靶基因则与预测的可能调控它们的miRNA表达趋势相反，2个靶基因的蛋白质水平表达结果与mRNA水平变 化趋势一致。

表2 重点miRNA与靶基因测序相对表达倍数

注：数值为相对表达变化倍数

表3  qRT-PCR 验证挑选的 miRNA 和靶基因

注：数值为相对表达变化倍数

讨论

肠道病毒71型手足口病是由肠道病毒71型（简称EV71）感染所引起的一种急性传染病[5]。好发于儿童，尤以3岁以下年龄组发病率最高，多数患者病情经过良好，少数重症患儿可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等并发症，极少数病情危重，可致死亡[1,6]。传播途径以手口接触传播为主，但早期呼吸道感染比消化道感染表现出更典型的病理改变，推测病毒与宿主肠道上皮细胞之间的相互作用可能对病毒感染的进程和后果产生重要的影响，而miRNA是病毒与宿主相互作用的重要桥梁[7]。因此，通过测序了解EV71感染肠道上皮细胞后外泌体miRNA表达谱的变化具有重要意义。

本研究对EV71感染肠道上皮细胞后外泌体中的miRNA表达谱进行了测序分析,并使用TargetScan和miRDB两个数据库对筛选出的在两种病毒感染后表达变化趋势一致的miRNA进行靶基因预测分析，得到上调miRNA的靶基因476个,下调miRNA的靶基因962个。结果表明，肠道上皮细胞外泌体中靶基因及其miRNA在病毒感染宿主后的免疫应答中发挥了重要作用，例如 JAK-STAT、Toll 样受体信号通路上都出现了差异表达的靶基因。这些miRNA 和靶基因将是后续进行深入分子机制研究的重要线索[8]。筛选得到的上调靶基因为NF-kB、MAPK14和田              GADD45A,其中 NF-kB1、MAPK14上调提示病毒感染激活了炎症相关的信号通路。而GADD45A是细胞生长阻滞和DNA损伤修复基因，在基因组稳定性维持、细胞周期阻滞和细胞凋亡中起重要作用。

本研究最后筛选出的miRNA中仅有let-7i-3p重叠，其原因可能是种属的差异，以及感染的靶细胞不同，本研究中病毒感染的靶细胞为肠道上皮细胞，而前期研究中感染的靶细胞为调的靶基因进行mRNA水平的验证，以及2个靶基 PBMC。此外，本研究分别挑选了3个上调和5个下调基因进行蛋白质水平的验证。结果显示高通量测序的结果能够在qRT-PCR和Western blot结果中得到验证。本研究结果为后续深入研究HFMD的致病机制提供了重要线索，也为阐明肠道上皮细胞外泌体中的miRNA在肠道病毒感染和致病机制中的作用提供了参考。

参考文献

[1]郑雪麟,胡雅洁,李慧,等.EV71和CVA16感染人呼吸道上皮细胞后参与免疫应答相关的microRNA和靶基因的分析[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2021, 41(11):852-859.

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[3]Ruan Z, Liang Y, Chen Z, et al. Enterovirus 71 non-structural protein 3A hijacks vacuolar protein sorting 25 to boost exosome biogenesis to facilitate viral replication. Front Microbiol. 2022 Oct 5;13:1024899. doi: 10.3389/fmicb.2022.1024899.

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[5]路延之.LncRNA miR-4443/NUPR1调控轴影响肠道病毒71型复制的机制研究[D].中国人民解放军空军军医大学,2021.35（6）:1021-1025

[6]周海银,陈艳英,隆彩霞,等. miRNA-296-5p介导PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制神经细胞SK-N-SH中EV71病毒复制的作用机制[J]. 中国医师杂志,2020,22:(05)：683-688.

[7]戚宇华,吴涛,朱小娟,等. 肠道病毒71型感染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的miRNA表达谱[J]. 国际病毒学杂志,2017,24:(5)：289-295.

[8]张国艳,李冀琛,张珂艺,等. 埃可病毒11型感染RD细胞的转录组学分析及PLK1对其感染影响的初步探究[J]. 中华实验和临床病毒学杂志,2021,35:(06)：605-611.

作者简介：杨爱平，男（1983-）副主任医师 临床微生物与免疫学方向

基金项目：上海市松江区科学技术攻关项目 (编号：22SJKJGG80)