简介：摘要目的制备抗汉城病毒(Seoul virus，SEOV)荧光单克隆抗体(单抗)，并初步应用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液的病毒灭活验证。方法以SEOV L-99株灭活病毒原液为免疫原，采用小鼠杂交瘤细胞融合技术，筛选抗SEOV特异性单抗杂交瘤；小鼠体内诱生法制备单抗腹水，蛋白A亲和层析纯化单抗，并以蛋白质印迹法鉴定其特异性；间接ELISA测定单抗效价和相对亲和力；纯化单抗采用搅拌法标记异硫氰酸荧光素，并分别采用直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法对Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液进行病毒灭活验证。结果共筛选出4株特异性抗SEOV L-99株杂交瘤1D5、2E3、3A4及5B7。蛋白质印迹法鉴定4株单抗均与SEOV L-99株核衣壳蛋白发生特异性反应；间接ELISA测定腹水效价为3.13×10－8~1.25×10－7；相对亲和力顺序为1D5>3A4>2E3>5B7；纯化抗体纯度>95%；异硫氰酸荧光素标记1D5株单抗的结合比率为3.4；直接免疫荧光法与小鼠脑内接种法检测盲传3代的Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗原液，病毒灭活验证结果一致。结论成功筛选到高效价特异性抗SEOV单抗，并制备成荧光单抗，可用于Ⅱ型肾综合征出血热灭活疫苗生产工艺中的病毒灭活验证。

简介：摘要目的建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，验证其检测性能，为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水，Protein-A亲和层析纯化腹水抗体，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度，间接ELISA法测定McAb效价，Western blot鉴定其特异性；叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后，通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度，建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准，验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度；通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果4株McAb腹水效价均>1∶106，抗体纯度均>98%；经Western blot鉴定，1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白，2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应；经抗体配对筛选后，选择3A4为包被抗体，1D5为标记抗体；棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml，HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml；线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml，R2>0.99；专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性；抗原回收率在95.8%~108.7%之间，精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。结论成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中，SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。

简介：摘要目的制备吸附重组戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)P179抗原的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂，并观察其免疫效果。方法乳化法制备海藻酸钠/壳聚糖微球，采用不同海藻酸钠浓度、混合乳化剂添加量、混合乳化剂亲水亲油平衡值设计正交试验，确定最佳制备工艺参数。将重组HEV P179抗原吸附在最佳工艺制备的微球表面，制备吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂，皮下多点免疫BALB/c小鼠，测定其诱导小鼠产生特异性IgG抗体的能力，与同剂量含弗氏佐剂的重组HEV P179免疫制剂对比。结果经正交试验确定乳化最佳工艺参数为：海藻酸钠质量分数1%、混合乳化剂体积分数2%，混合乳化剂亲水亲油平衡值4。制备的微球平均粒径为6.73 μm(分布范围3.90～9.10 μm，方差1.78 μm)，形态较为均一，透射电镜观察结果与双层球体及内部疏松多孔的微球结构特点相符。用此条件制备抗原质量浓度为500 μg/ml的混悬制剂，微球对抗原的吸附率为90.64%。免疫效果观察试验结果表明，皮下多点免疫试验中微球制剂诱导特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原。结论成功制备了吸附重组HEV P179的海藻酸钠/壳聚糖微球混悬制剂，且诱导产生特异性IgG抗体的能力优于含弗氏佐剂抗原，为其在新型实验动物超敏制剂中的应用奠定了基础。