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  • 简介:摘要目的探讨肿瘤抑制因子微小RNA(miRNA,miR)-149-5p对肾癌细胞转移潜能的影响及机制。方法GRC-1细胞分成miR-149-5p组(转染miR-149-5p mimics)、miR-NC组(转染mimics control)、miR-149-5p+丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1(SRPK1)组(共转染miR-149-5p mimics、pcDNA3.1-SRPK1)、miR-149-5p+vector组(共转染miR-149-5p mimics、pcDNA3.1)。实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-149-5p水平,Transwell小室测定细胞侵袭和迁移能力变化,蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平。利用在线靶基因预测软件发现SRPK1可能是miR-149-5p的靶基因,双荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。应用SPSS 21.0统计软件分析。结果miR-149-5p组的GRC-1细胞中miR-149-5p(2.69±0.27比1.01±0.08)和E-cadherin(0.81±0.09比0.42±0.05)水平显著高于miR-NC组,侵袭数目[(70.81±6.35)个比(110.64±9.67)个] 、迁移数目[(108.46±9.27)个比(162.76±12.71)个]、N-cadherin(0.46±0.05比0.79±0.11)和SRPK1(0.45±0.06比0.92±0.08)蛋白水平显著低于miR-NC组,差异均有统计学意义(FmiR-149-5p=95.385,F侵袭数目=20.216,F迁移数目=22.010,FN-cadherin=15.100,FE-cadherin=31.331,FSRPK1=31.785,P<0.05)。共转染SRPK1野生型质粒的miR-149-5p组细胞荧光素酶活性(0.37±0.04比1.00±0.11)显著低于miR-NC组,差异有统计学意义(t=16.150,P<0.05)。共转染SRPK1突变型质粒的miR-149-5p组细胞荧光素酶活性(0.99±0.10比1.00±0.09)与miR-NC组比较差异无统计学意义(t=0.220,P>0.05)。miR-149-5p+SRPK1组的GRC-1细胞中E-cadherin(0.45±0.04比0.80±0.08)水平显著低于miR-149-5p+vector组,侵袭数目[(99.51±7.48)个比(71.84±5.37)个]、迁移数目[(145.06±11.14)个比(107.63±10.20)个]、N-cadherin(0.86±0.10比0.47±0.04)和SRPK1(0.89±0.06比0.50±0.07)蛋白水平显著高于miR-149-5p+vector组,差异均有统计学意义(tSRPK1=7.327,t侵袭数目=5.205,t迁移数目=4.292,tN-cadherin=6.272,tE-cadherin=6.778,P<0.05)。结论肿瘤抑制因子miR-149-5p靶向负调控SRPK1表达降低肾癌细胞的迁移和侵袭能力。

  • 标签: 微小RSA-149-5p 丝氨酸-精氨酸蛋白激酶1 肾癌 转移 侵袭
  • 简介:摘要目的建立一种体外连续传代培养小鼠膀胱平滑肌细胞(BSMCs)的方法并探讨纤维连接蛋白1(FN1)沉默对小鼠BSMCs周期分布和凋亡的影响。方法采取多酶联合消化法进行原代培养,分离获取小鼠原代BSMCs,通过形态学观察和免疫荧光法对细胞进行鉴定;使用细胞计数试剂盒(CCK-8)法对其增殖特性进行检测。使用针对FN1的小干扰RNA(FN1-siRNA)转染BSMCs,将体外培养的BSMCs分为空白组(未转染)、阴性对照组(转染阴性对照NC-siRNA)和干扰组(转染FN1-siRNA),流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。3组间以上指标的比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验。结果从小鼠中获得的BSMCs纯度可达97%,细胞呈典型的"峰-谷"样结构。免疫荧光鉴定可见胞质内α-平滑肌动蛋白(α-SMA)阳性表达。FN1-siRNA转染后[G0/G1(68.20±3.82)%、S(17.78±1.48)%、G2/M(14.04±2.04)%]与转染前[G0/G1(49.59±2.38)%、S(28.75±1.94)%、G2/M (21.71±1.93)%]比较,增殖水平降低;与转染前[(3.12±0.65)%]比较,转染后[(17.36±2.62)%]凋亡率升高(F=89.346,P<0.05)。结论体外培养获得的小鼠BSMCs具有较好增殖能力。靶向沉默FN1的表达可诱导BSMCs周期阻滞和凋亡。

  • 标签: 膀胱平滑肌细胞 原代培养 纤维连接蛋白1 细胞周期 脱噬作用
  • 简介:摘要目的探讨白细胞介素(IL)-37对肾癌细胞786-O增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法将肾癌细胞786-O分为对照组、不同剂量(12.5、50.0、200.0 ng/ml)重组IL-37蛋白组、pcDNA组、pcDNA-红细胞膜蛋白带4.1类似物4a的反义RNA1(EPB41L4A-AS1)组、200 ng/ml IL-37+si-NC组和200 ng/ml IL-37+si-EPB41L4A-AS1组,细胞计数试剂盒(CCK-8)法和克隆形成实验检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell检测细胞侵袭,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测EPB41L4A-AS1和miR-106b-5p表达。双荧光素酶报告基因实验验证EPB41L4A-AS1和miR-106b-5p调控关系。两组间比较行t检验;多组间比较采用单因素方差分析,组间进一步两两比较行LSD-t检验。结果12.5、50、200 ng/ml IL-37组786-O细胞吸光度(A)值(0.58±0.02、0.43±0.03、0.29±0.02比0.69±0.06,F=207.113,P<0.05)、克隆形成数[(114.33±6.61)、(87.33±5.22)、(51.33±4.92)个比(139.44±9.49)个,F=277.041,P<0.05]、划痕愈合率[(69.03±0.35)%、(54.9±1.84)%、(38.81±2.73)%比(85.08±0.91)%,F=1 191.221,P<0.05]和侵袭数[(91.44±5.68)、(70.89±2.85)、(48.78±6.00)个比(112.44±6.62)个,F=223.386,P<0.05]均低于对照组,差异均有统计学意义,细胞中EPB41L4A-AS1表达高于对照组(1.39±0.15、1.71±0.18、2.18±0.20比1.01±0.10,F=84.386,P<0.05),差异均有统计学意义,miR-106b-5p表达低于对照组(0.82±0.06、0.60±0.09、0.40±0.06比1.00±0.12,F=82.545,P<0.05),差异均有统计学意义,且呈剂量依赖性。pcDNA-EPB41L4A-AS1组786-O细胞(0.23±0.02比0.69±0.05,t=25.626,P<0.05)、克隆形成数[(45.33±3.32)个比(137.78±7.01)个,t=35.757,P<0.05]、划痕愈合率[(35.01±3.27)%比(85.11±1.29)%,t=42.757,P<0.05]和侵袭数[(44.56±4.48)个比(109.44±8.59)个,t=20.091,P<0.05]均降低,差异均有统计学意义。EPB41L4A-AS1可靶向负调控miR-106b-5p。200 ng/ml IL-37+si-EPB41L4A-AS1组786-O细胞中EPB41L4A-AS1表达低于200 ng/ml IL-37+si-NC组(1.14±0.13比2.49±0.19,t=17.592,P<0.05),差异均有统计学意义,miR-106b-5p表达高于200 ng/ml IL-37+si-NC组(0.91±0.09比0.43±0.08,t=11.959,P<0.05),差异均有统计学意义,细胞A值(0.64±0.06比0.31±0.04,t=13.729,P<0.05)、克隆形成数[(123.33±6.18)个比(49.22±3.23)个,t=31.884,P<0.05]、划痕愈合率[(74.90±0.95)%比(38.15±2.17)%,t=46.542,P<0.05]和侵袭数[(92.89±5.25)个比(47.44±4.13)个,t=20.412,P<0.05]均高于200 ng/ml IL-37+si-NC组,差异均有统计学意义。结论IL-37可能通过调控EPB41L4A-AS1/miR-106b-5p轴抑制肾癌细胞786-O增殖、迁移和侵袭。

  • 标签: 白细胞介素-37 肾癌 微小RNA 增殖 迁移 侵袭
  • 简介:摘要目的建立小鼠神经源性膀胱动物模型,探讨纤维连接蛋白1(FN1)的变化及微小RNA(miRNA,miR)-1a-3p的作用机制。方法C57BL/6J雌性7周龄小鼠40只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),分为模型组和对照组,模型组皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白及结核分支杆菌,并48 h腹腔注射百日咳毒素;对照组皮下注射生理盐水。观察小鼠排尿频次、排尿量等变化。处死小鼠并取膀胱组织,模型组和对照组各选取3只膀胱进行高通量测序。采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、蛋白印迹法(Western blot)检测小鼠膀胱组织中FN1和miR-1a-3p的变化。多组计量资料采用One-way ANOVA。结果对测序结果进行分析,随着泌尿系统症状加重,FN1增加(4.569±0.426,t=-5.142,P<0.01),而miR-1a-3p减少(1.623±0.312,t=-3.945,P<0.05),差异有统计学意义。与对照组比较,模型组膀胱组织中FN1的mRNA[2.501(1.301,4.251),F=99.183,P<0.01]和蛋白[2.937(1.174,4.262),F=63.834,P<0.01]表达均上调,差异有统计学意义,而miR-1a-3p[2.401(1.250,3.001), F=35.951,P<0.01]表达下调,差异有统计学意义;双荧光素酶基因报告表明FN1为miR-1a-3p的直接靶基因(0.514±0.027,t=13.355,P<0.01),差异有统计学意义。结论神经源性膀胱动物模型出现尿频、尿急、尿潴留等症状,且FN1表达明显上调,而miR-1a-3p表达下调,因此miR-1a-3p可能通过对FN1调控参与神经源性膀胱发生发展。

  • 标签: 神经源性膀胱 纤维连接蛋白1 微小RNA-1a-3p
  • 简介:摘要目的探讨长链非编码RNA核仁小RNA宿主基因8(lncRNA SNHG8)对肾癌细胞增殖、侵袭、迁移和顺铂敏感性的影响及其分子机制。方法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测SNHG8和微小RNA(miR)-224-3p表达水平;蛋白质印迹(Western blot)法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、细胞增殖核抗原Ki-67(Ki-67)、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)和多药耐药基因1(MDR1)蛋白表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞存活率和顺铂半数抑制浓度(IC50);Transwell检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡;荧光素酶报告实验检测SNHG8和miR-224-3p的靶向关系。两组比较采用t检验。结果肾癌细胞系ACHN、786-O和A498中SNHG8高表达(1.05±0.09比4.58±0.47、6.19±0.52、5.37±0.48,t=22.130、29.219、26.538,P<0.05),miR-224-3p低表达(1.02±0.08比0.53±0.07、0.41±0.06、0.47±0.08,t=13.829、18.300、14.584,P<0.05)。与si-con组相比,si-SNHG8组,肾癌细胞786-O中MMP-2、Ki-67、MDR1表达降低,cleaved Caspase-3表达升高,细胞存活率降低[(69.86±6.37)%比(96.42±9.26)%,t=7.089,P<0.05],迁移和侵袭数[(175.64±12.20)个比(292.70±20.45)个、(92.81±8.38)个比(147.24±15.93)个,t=14.748、9.072,P<0.05]降低,凋亡率升高[(19.48±2.28)%比(4.28±0.64)%,t=19.256,P<0.05],顺铂IC50值降低(1.47±0.14比7.81±0.22,t=19.454,P<0.05)。过表达miR-224-3p后,肾癌细胞786-O中MMP-2、Ki-67、MDR1表达降低,cleaved Caspase-3表达升高,细胞存活率降低[(67.36±8.65)%比(98.24±9.53)%,t=7.198,P<0.05],迁移和侵袭数[(155.81±16.67)个比(274.73±28.61)个、(72.96±8.35)个比(156.61±14.28)个,t=10.774、15.170,P<0.05]降低,凋亡率升高[(18.49±2.28)%比(4.67±0.63)%,t=17.527,P<0.05],顺铂IC50值降低(1.79±0.15比6.72±0.26,t=49.273,P<0.05)。结论沉默SNHG8可抑制肾癌细胞786-O增殖、迁移、侵袭,促进细胞凋亡,增强其对顺铂的敏感性;其机制可能与miR-224-3p有关。

  • 标签: 核仁小RNA宿主基因8 微小RNA-224-3p 肾癌 增殖 侵袭 迁移 凋亡 顺铂敏感性