简介:为了解羊肚菌(Morchellaesculenta)菌丝抗原物质的识别特征及其在菌丝上的分布,利用免疫酶染色法(Immunoenzymeassay,IEA)对两株抗羊肚菌单克隆抗体(W8C9,C6A8)在羊肚菌菌丝上对应的特异性结合靶点进行定位研究。初步确定了两株单克隆抗体对应的羊肚菌菌丝抗原在菌丝上的位置,并确定了W8C9、C6A8和兔多克隆抗体稀释后适合工作的体积分数分别为5.0%、4.5%、4.0%。
简介:为了研究黏菌孢囊形成过程中显微结构的变化,文中探讨了番红-固绿和铁帆-苏木精染色条件下淡黄绒泡菌和全白绒泡菌孢囊不同发育阶段显微结构的差异显示效果。结果表明:在幼孢囊中原质团有种水平的割裂,大割裂和微割裂,这些割裂和孢丝及孢子的形成有关;全白绒泡菌囊轴表现了和孢囊柄不一致的状态和染色结果;番红-固绿染色下,淡黄绒泡菌在孢囊形成前期原质团被染成淡红色,可以分辨出大量游离存在的细胞核;孢囊壁及囊轴被染成绿色,孢子灰绿色;全白绒泡菌原质团被染成绿色,初期可见较厚孢囊壁,囊轴绿色。铁帆-苏木精染色下,淡黄绒泡菌和全白绒泡菌原质团均被染成灰色,囊壁不明显,成熟孢子发生皱缩。
简介:糖基水解酶Lxyl-pl-1和Lxyl-p1-2是天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室克隆自真菌香菇的重组蛋白,具有β-木糖苷酶/β-葡萄糖苷酶双重活性,能专一性水解脱除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等的木糖基,生成的C-7位羟基化产物可以作为前体半合成重要的抗肿瘤药物紫杉醇或其类似物。前期工作显示:Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2的序列同源性高达97%,但后者的催化活性是前者的2倍以上;Lxyl—pl-2水解生色底物PNP-Xyl的最适温度为50℃,最适pH为4.0。为系统地观察两酶的催化特性,在对天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室构建的工程酵母进行培养、诱导7d后冷冻干燥菌体。将冷干的菌体破碎得到蛋白粗提物,再经过Ni亲和色谱和HPLC凝胶色谱法制备和纯化得到Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2重组蛋白。以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc及7-木糖紫杉烷底物7.木糖-10-去乙酰紫杉醇(XDT)与重组酶进行反应,重点测定Lxyl-p1-2水解XDT的最适温度和最适pH,并在最适条件下测定重组酶对不同底物的动力学参数。试验结果表明:Lxyl-pl-2水解底物XDT的最适温度为45%,最适pH为4.5;动力学测定结果显示:Lxyl—pl-1和Lxyl-p1-2的β-葡萄糖苷酶活性均显著高于其β-木糖苷酶活性,这与之前的研究结果相一致;Lxyl-p1-1对于底物PNP-Xyl,PNP-Glc和XDT的kcat/Km值分别低于Lxyl-p1-2对于上述3种底物的kcat/Kan值(0.77s-1×mM-1,1.65s-l×mM-1和-1×mM-lVS.1.67S-1xmM-1,2.85S-1×mM-1和1.07S-1×mM-1)。
简介:糖苷水解酶第一家族(GH1)β-葡萄糖苷酶(BGL1)有葡萄糖耐受性,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性有很大影响,但具体作用机制尚不清楚。对嗜热革节孢GH1BGL1进口端的W168、L173、F348、W349、C169、F180、D237、Y179、A260、H307、N335和E437这12个氨基酸残基进行定点突变,将突变酶与野生酶(WT)在毕赤酵母中表达,表达产物纯化后进行酶活性和葡萄糖耐受性测定。与WT相比,所有突变酶活性均有所降低,其中W168H、N335F和W349G几乎丧失活性。突变F180H、D237S、A260N和H307Y的Km低于WT,所有突变的kcat都降低。除L173Q外,其余突变都保持葡萄糖耐受性,在高浓度(400mmol/L)葡萄糖时,Y179F和D237S酶活受到显著抑制。本研究表明,进口端位点对酶活性及葡萄糖耐受性均具有一定影响,催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。