简介:目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(AgeI/EcoRI)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-TimePCR和Western检测三组E2F-1mRNA和蛋白的表达水平。结果:经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论:靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。
简介:目的:研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)对小鼠骨髓基质细胞系ST-2在成骨分化过程中Eph受体酪氨酸激酶A4基因(EphA4)表达的影响。方法:使用终浓度10μg/mL的Pg-LPS与ST-2细胞共培养,分别在培养第1、3和7天,采用RT-PCR技术检测EphA4基因及Runt相关转录因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)和碱性磷酸酶(ALP)等成骨相关基因的表达。结果:实验组EphA4基因表达在培养第1、3和7天时比对照组分别减少2.5、2.4和2.3倍,两组之间存在显著差异(P〈0.01);实验组Runx2基因表达在培养第1、3天比对照组减少,两组之间存在显著差异(P〈0.01),但在第7天两组表达均不明显;实验组ColⅠ和ALP基因表达在培养第1、3和7天时均比对照组减少,差异有统计学意义(P〈0.01)。结论:Pg-LPS能抑制ST-2细胞成骨分化过程中EphA4基因的表达,同时也抑制成骨相关基因Runx2、ColⅠ和ALP的表达。
简介:目的鉴于骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)异源二聚体较BMP同源二聚体有更高效的诱导成骨作用,比较研究纯化的重组人BMP2/7(rhBMP2/7)异源二聚体与rhBMP2和/或rhBMP7同源二聚体在诱导细胞成骨分化上相关基因的表达变化.方法以不同浓度的3种rhBMPs作用于成骨前体细胞MC3T3-E1,检测细胞碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性变化,比较研究成骨分化相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(collagentypeⅠα1,Coll)以及核心结合因子(runt-relatedtranscriptionfactor2,Runx2/corebindingfactorαl,Cbfαl)的表达变化.结果RhBMP2/7异源二聚体上调细胞ALP活性的浓度效应呈钟形曲线;其诱导细胞成骨相关基因的表达也呈类似的钟形曲线;而相应的同源二聚体则呈现浓度依赖效应递增曲线.此外,rhBMP2/7异源二聚体与rhBMPs同源二聚体相比,诱导的Runx2的基因表达变化不同于ALP、OCN或Coll基因表达,提示后3种基因的表达并不完全依赖于Runx2基因的表达转录.结论RhBMP2/7异源二聚体在诱导细胞成骨分化基因表达上仅在早期以及较低浓度范围内与相应rhBMPs同源二聚体有显著性差异;基因表达转录后,成骨相关蛋白的合成、修饰及活化程度不同更可能是造成rhBMP2/7异源二聚体与相应同源二聚体生物学活性差异的主要原因.
简介:目的:研究小鼠舌肌发育的分子调控机制。方法:取胚胎第13.25天(E13.25)及E15.5小鼠舌组织。应用Affy-metrixMouseGeneChip,对胎鼠舌发育过程中的差异基因进行筛选。应用DAVID网络分析工具对基因进行功能和聚类分析。结果:基因功能和聚类分析表明,在E13.25高表达的基因主要与细胞周期相关因子(Exo1、Gsk3B、Kif20b、Skp2)和细胞粘附因子(Neo1、lama1)等相关。在E15.5高表达的基因主要与细胞骨架(titin、Hspb7)相关。结论:小鼠舌组织增殖和特化与细胞周期和细胞粘附基因相关,舌组织分化和成熟主要与细胞骨架相关。
简介:目的:通过筛选小鼠下颌下腺发育起关键作用的基因,并预测其基因功能,为唾液腺组织工程奠定实验基础。方法:选取小鼠胚胎第18.5天、19.5天、出生后当天、出生后3天等4个不同时期的下颌下腺,进行基因芯片检测,BeadStation500System扫描仪(illumina,Inc.)对芯片扫描,然后采用BeadStudioGeneExpressionModule图像分析软件(illumina,Inc.)对芯片灰度扫描图进行分析,构建小鼠下颌下腺的全基因表达谱。应用生物信息学STC法分析基因表达趋势,建立发育时间与基因表达相关的调控网络图,从网络中筛选关键基因,预测其基因功能,并对关键基因Skp2进行实时荧光定量PCR验证。结果:应用STC生物学方法,得到差异基因的8种显著性表达趋势,其中有4种与表型相关。构建网络图筛选关键基因,得到Ddx1、Cenpl、Fanci、Skp2、Rbm4、Dak。Skp2基因检测数据与实时荧光定量PCR验证结果一致。其中Skp2与胚胎期细胞的分化、增殖密切相关。结论:6个关键基因在小鼠下颌下腺发育过程中起重要作用。
简介:目的对人唾液腺腺样囊性癌肺高转移细胞株(ACC-M)和肺低转移细胞株(ACC-2)差异表达的部分基因进行克隆和蛋白表达研究.方法应用cDNA基因表达谱芯片,对ACC-2及ACC-M细胞所检测的基因差异表达数据,结合NCBI和生物信息学软件分析技术,利用RT-PCR方法,克隆ACC-2和ACC-M表达有显著差异基因的EST,将得到的EST重组至质粒PET-24a-d(+)中,构建表达质粒;质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后表达目的蛋白.结果克隆了RAB7L1、h4F2hc、G8、L6、K1AA0119共5个差异表达基因,成功构建表达载体,EST测序结果与GeneBank对照一致,5个EST均可表达目的蛋白.结论从ACC-2和ACC-M细胞差异表达基因中,可克隆到能够表达目的蛋白的新基因,这些基因可能与腺样囊性癌转移表型产生有关.
简介:目的:测定B、C、D色系IPSE.max牙本质瓷的无限光学厚度。方法:制作直径为13mm,厚度为1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0mm的IPSE.maxB1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4、D2、D3、D4色号的盘状牙本质瓷试样,应用美能达CM-5分光测色计测试E.max牙本质瓷在标准黑、白背景条件下的色差值(ΔE),利用拟合回归方程计算出ΔE等于1.5时各色号牙本质瓷的厚度值。结果:B色系牙本质瓷的无限光学厚度值(ΔE=1.5)为3.046-3.692;C色系为2.680-2.799;D色系为2.429-2.766;11个回归方程的决定系数范围在0.944-0.988,拟合度良好。结论:相同厚度的条件下,随着色号增高,色差值逐渐减小,遮色能力逐渐增强。相同色号的条件下,随着厚度增加,色差值逐渐减小,遮色能力逐渐增强。
简介:目的:探究多巴胺与多巴胺复合Ⅰ型胶原对成骨细胞MC3T3-E1初期粘附的影响。方法:分别在多巴胺改性、多巴胺复合Ⅰ型胶原改性的玻片和空白玻片上培养MC3T3-E1细胞。采用CCK-8法检测细胞体外增殖能力。通过场发射扫描电镜、激光共聚焦显微镜以及体式显微镜分别观察MC3T3-E1细胞早期粘附形态。结果:MC3T3-E1细胞在三组玻片上培养1、3、7d的增殖结果差异无统计学意义(P>0.05)。相对于空白玻片组,MC3T3-E1细胞在多巴胺以及多巴胺复合Ⅰ型胶原组上铺展、粘附形态更好。结论:多巴胺促进成骨细胞粘附,多巴胺复合Ⅰ型胶原同样是理想的促粘附手段。两者在骨组织工程中是良好的表面改性手段。