简介：目的构建人神经元正五聚蛋白2（NPTX2）真核表达载体，转染人胰腺癌细胞PANC1，建立稳定转染的细胞系。方法通过双酶切的方法获得人NPTX2全长cDNA，利用NotⅠ和EcoRⅠ酶切位点将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋），经酶切和测序验证后，用脂质体转染法转染PANC1细胞，通过G418筛选，建立稳定转染的PANC1细胞，用实时定量PCR方法筛选NPTX2mRNA高表达克隆。结果成功构建了pcDNA3．1（＋）-NPTX2真核表达载体，并建立了稳定转染的PANC1细胞，成功表达了目的基因。结论真核表达载体的构建和稳定转染PANC1细胞系的建立为进一步研究NPTX2基因在胰腺癌细胞的作用奠定了良好的基础。

简介：目的构建针对人胰腺癌细胞株CFPAC1增殖诱导配体（aproliferation—inducingligand，APRIL）基因的shRNA慢病毒表达载体。方法应用基因工程技术，筛选出针对APRIL基因的RNAi靶序列，与pGCL—GFP载体连接，构建慢病毒表达载体LV—shAPRIL；将连接产物转化到DH5a感受态细胞，经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。再用LV—shAPRIL、pHelper1．0、pHdper2．0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒。重组慢病毒感染CFPAC1细胞，实时定量PCR和Westernblotting检测CFPAC1细胞APRILmRNA和蛋白的表达。结果PCR和测序结果与构建的慢病毒载体的预期结果一致，经包装产生的病毒滴度为5×10^7Tu／ml。构建的慢病毒载体感染CFPAC1细胞后第4天、第4周和第8周，APRILmRNA表达量较空载体慢病毒感染组分别下降了73％、70％和71％；APRIL蛋白表达量分别下降了66％、63％和62％（P〈0．05）。而各时间段未感染慢病毒的细胞组与空载体组相比无明显差异（P〉0．05）。结论成功构建了APRIL基因的shRNA慢病毒表达载体LV—shAPRIL。

简介：RNA干扰（RNAinterference，RNAi）是指生物体内由双链RNA介导同源序列mRNA的特异性降解，从而导致基因沉默的现象。

简介：目的：构建含解耦联蛋白2（UCP2）-3’非翻译区（UTR）序列的野生型和突变型质粒的双荧光素酶报告基因载体．探讨微小RNA（miR）-15b对UCP2基因表达的调控作用。方法：应用生物信息软件预测miR-15b的靶基因，分别将预测靶基因UCP2的3’UTR及其突变体克隆到荧光素酶载体DsiCHECK-2骨架中，构建UCP2野生型和突变型质粒。并采用测序方法鉴定DsiCHECK-2-UCP2载体是否构建成功。将UCP2野生型和突变型质粒分别与miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照在293T细胞中共转染。通过双荧光素酶报告基因检测分析miR-15b对UCP2基因表达的调控作用。结果：测序鉴定证实psiCHECK-2-UCP2双荧光素酶报告基因载体构建成功。双荧光素酶报告基因检测显示转染UCP2野生型和UCP2突变型报告基因的293T细胞过表达miR-15b后，UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显下降．下调31％（P=0．003），过表达miR-15b抑制剂后，UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显增加，上调46％（P=0．01）。而miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照对UCP2突变型的表达均无明显影响（P〉0．05）。结论：UCP2是miR-15b直接作用的靶基因，且miR-15b结合于UCP2基因3’UTR区域．转录后水平对UCP2有直接的抑制作用。

简介：目的目前的硫化氢（H2S）研究仍缺乏理想的供体。本研究旨在利用介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）合成一种新型的控释H2S供体，并评价其在体外实验中释放H2s的特点。方法溶胶。凝胶法制备均一大小的MSN。将二烯丙基三硫化物（DATS）负载至MSN孔道中，合成控释H2S系统（DATS-MSN）。分析其表征、释放H2S的特点、细胞毒性聃细胞摄取能力。结果DATS-MSN可在体外缓慢、持续、可调节的释放H2s。其可被心肌细胞成功摄取，在常规应用的浓度范围内未见明显细胞毒性。结论DATS-MSN可在体外环境中缓慢而可控的释放H2S，并具备良好的体外安全性，是H2S体外研究的良好工具。

简介：目的构建鼠野生型肿瘤坏死因子（Wildtypetumornecrosisfactor—alpha，wtTNF—α）和跨膜型肿瘤坏死因子（Transmembranetumornecrosisfactor—alpha，tmTNF—α）基因真核表达载体，转染心肌细胞，比较两型TNF—α对心肌细胞凋亡的影响。方法应用RT—PCR方法从小鼠腹腔臣噬细胞中扩增wtTNF—α基因编码区，根据小鼠TNF氨基酸序列设计缺失肿瘤坏死因子转化酶（TNFalphaconvertingenzyme，TACE）作用位点（缺失1-12位氨基酸）的突变引物，通过重叠PCR得到构建不被TACE剪切的TNF-α突变体，即跨膜型肿瘤坏死因子tmTNF—α，扩增得到的wtTNF-α，tmTNF—αPCR产物经EcoRI＋BanHI双酶切后克隆到pIRES2-EGFP真核表达载体中并转染入大鼠H9c2（2—1）心肌细胞，用RT—PCR及WesternBlot方法鉴定转染效率及不同表达载体对心肌细胞凋亡的影响。结果成功构建pIRES2-eGFP—wtTNF和pIRES2-eGFP-tmTNF真核表达载体并转染大鼠H9c2（2—1）心肌细胞，tmTNF—α对心肌细胞无明显促凋亡作用，而wtTNF—α可以诱导心肌细胞凋亡。结论由于wtTNF—α可被酶解产生sTNF-α，提示sTNF—α，而并非跨膜型TNF-α对该心肌细胞株具有诱导凋亡的作用。