简介:目的:制备石墨烯(G)/聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)三维多孔复合支架,研究G/PLGA三维多孔复合支架作为骨组织支架材料的可行性。方法:不同质量比的G与PLGA(0,0.5‰,5‰)均匀混合,利用碳酸氢钠致孔制备多孔G/PLGA三维复合支架。通过CCK-8检测、细胞骨架染色、碱性磷酸酶(ALP)活性分析以及RT-PCR实验检测支架材料的细胞毒性及其对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及分化的影响。结果:扫描电镜结果显示所制备的G/PLGA三维支架材料具有连通的多孔结构,G在支架中均匀分布。CCK-8检测结果显示G/PLGA三维支架无明显细胞毒性。与单纯PLGA支架组相比,G/PLGA三维多孔支架组的BMSCs表达ALP活性有所增加,成骨相关基因表达随G含量升高呈明显上调,其中含有5‰G的复合三维多孔支架的促成骨分化作用最明显。结论:本实验所制备的G/PLGA三维多孔支架具有良好的生物相容性,能够促进BMSCs体外成骨分化,有望作为新型骨组织工程支架材料。
简介:目的:观察人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordderivedmesenchymalstemcells,hUCMSCs)体外长期传代扩增后形态表型、增殖及分化特性的变化。方法:分别以双酶消化及组织块法分离培养hUCMSCs;细胞传至18代(P18),观察细胞形态、生长曲线、克隆形成、细胞周期、干细胞表型、多向分化能力的变化,全面评测连续传代对hUCMSCs生物学特性的影响。结果:双酶消化结合组织块法可高效分离获得大量hUCMSCs,细胞稳定传代并保持间充质干细胞特性;早期细胞多呈长梭形或纺锤形,至P18时呈多角不定型且细胞体积变大,胞浆增加明显。传代至P18后,hUCMSCs的群体倍增时间增加至60h以上,绝大多数细胞处于G0/G1期,且成纤维细胞集落形成单位(colony-formingunit-fibroblast,CFU-F)形成降低,克隆集落减小。hUCMSCs可表达且不因持续传代丢失间充质干细胞标记,但仅早期传代细胞表达多能干细胞标记Oct-4及SSEA-4。特异性染色及相关基因表达检测提示P18hUCMSCs的成脂肪、成软骨及成骨诱导分化能力较早期传代细胞减弱。结论:hUCMSCs是具备高增殖活性和多向分化特性的间充质干细胞群,体外长期传代扩增的hUCMSCs呈现一定的复制性衰老趋势,但不会丢失干性,可稳定表达间充质干细胞特异性表面标记并保持分化活性。
简介:本文初步报道了应用频率可调式压电骨刀进行牙槽嵴增宽和同期种植体植入的新技术,这是以往其它任何手术方法均不能实现的。此技术包括将唇/颊侧骨瓣与腭侧骨瓣分离来增宽牙槽嵴以及在两皮质骨瓣间即刻植入种植体两部分。本文中报道的病例逐步演示了牙槽嵴增宽和种植体植入的全过程,此病例牙槽嵴为Ⅰ-Ⅱ型骨质,整体高均保持2-3mm厚度。为促进愈合,遵循组织工程的原则,在种植体植入后两骨瓣间剩余扩展间隙内填入生物活性玻璃合成骨移植材料和富含血小板的自体血浆混合物,分别作为骨诱导因子和骨引导因子。种植区域用富含血小板的血浆膜覆盖。术后3个月重新暴露,经仔细观察,发现牙槽嵴植骨区已矿化,厚度稳定约5mm,种植体已形成骨结合。
简介:目的:通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apicalbud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源间充质干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、Apicalbud上皮细胞,制备Apicalbud上皮条件诱导液并体外对ADSCs诱导7d,通过实时定量PCR方法检测成牙本质关键基因DMP-1及DSPP的表达。制备ADSCs及Apicalbud上皮重组细胞团进行大鼠肾被膜下移植,8W后取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果:Apicalbud上皮诱导ADSCs后DMP-1及DSPPmRNA表达水平显著高于对照组。体内移植8W后HE染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构,Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构,免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论:Apicalbud上皮细胞在体外能够诱导ADSCs向成牙本质细胞分化,且细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。
简介:目的研究雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨分化以及对微小RNA(miR-20a、miR-29a)表达水平的影响。方法分离培养大鼠BMSC,将细胞分3组分别进行处理,使用完全培养基培养组作为空白对照记为CM,成骨诱导液培养组作为对照记为OM,成骨诱导液+17β雌二醇(E2)培养组作为实验组记为E2。细胞处理第1、5、9天进行碱性磷酸酶(ALP)活性检测;第5、9天,蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测成骨相关蛋白如Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨形态发生蛋白2(BMP2)、骨桥蛋白(OPN)的表达情况,定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-20a及miR29a的表达情况;第19天,茜素红染色检测矿化结节的形成情况。两组数据的结果进行两组独立样本的t检验,两组以上的数据进行单因素方差分析,检验水准为P〈0.05。结果处理1d后,各组ALP活性较低,组间差异无统计学意义(CM1d:3.49,OM1d:2.82,E21d:2.92;F=2.002,P=0.216);5d后,E2组及OM组ALP活性较1d时明显提高(E21d:2.92,E25d:15.83;t=5.065,P=0.007;OM1d:2.82,OM5d:8.38;t=13.39,P=0.0002),5d时E2的值为OM组的2倍、CM组的4倍,差异有统计学意义(F=13.95,P=0.0055);9d后,各组ALP活性水平有明显增高(CM9d:14.66,OM9d:22.17,E29d:45.99),约为5d时的3倍(CM:t=11.830,P=0.0003;OM:t=8.068,P=0.0013;E2:t=9.332,P=0.0007),组间差异变化不明显,OM组约为CM组1.5倍,E2组约为OM组2倍,差异有统计学意义(F=119.1,P〈0.0001)。第5、9天,E2组成骨相关蛋白表达水平在均比OM、CM组高。第19天,E2组比OM组形成更多矿化结节。E2组miR-20a-5p表达水平在第5天为OM组的2倍(Mann-WhitneyU=20.000,P=0.013),在第9天为OM组的1.5倍(Mann-WhitneyU=32.000,P=0.079);而miR-29a-3p的表达水平相比OM组无明显变化(5d:Mann-WhitneyU=0.000,P〉0.999,Mann-WhitneyU=10.000,9d:P=0.680)。结论E2能促进大鼠BMSC的成骨分化,同时提高miR-20a-5p�
简介:目的:探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外多潜能性及成骨分化能力的影响。方法:组织贴壁培养法分离培养女性下颌骨来源BMSCs,CCK-8法检测不同浓度的HSYA对BMSCs生长的影响;Westernblot及RTPCR方法检测加入HYSA的BMSCs的多潜能转录因子NANOG、SOX2、OCT4的表达,比较两组细胞的克隆形成率;茜素红染色、Westernblot、实时定量RT-PCR检测空白组、阳性对照组及实验组的体外成骨分化能力。结果:与对照组相比,实验组多潜能因子NANOG、SOX2及OCT4蛋白及mRNA表达水平升高,差异具有统计学意义;体外成骨诱导7d后,实验组BMSCs中Runx2等成骨分化基因表达上升,诱导14d后,钙结节形成较空白组及标准组多。结论:HYSA能促进BMSCs的增殖,同时在Runx2、OCN、OSX、OPN的参与下,诱导其向成骨方向分化。
简介:目的探讨口腔鳞状细胞癌(OSCC)Tca8113细胞中透明质酸酶(HAase)的表达及意义。方法以正常人牙龈上皮细胞作对照.采用RT-PCR、免疫荧光技术检测人OSCCTca8113细胞株中HAase的mRNA水平及其蛋白表达。结果HAase主要在Tca8113细胞和正常上皮细胞胞浆内表达;HAasemRNA的半定量检测表明.Tca8113细胞内HAase的表达强度比相对应的正常牙龈上皮细胞内HAase的表达强度显著增高,差异有统计学意义。结论细胞胞浆中HAase的表达水平可能与细胞的恶变有关。
简介:目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)在绝经后骨质疏松的环境中对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨分化的影响。方法:建立绝经后骨质疏松小鼠模型(OVX组,卵巢摘除),通过Micro-CT、实时定量RT-PCR、茜素红和碱性磷酸酶(ALP)染色等技术比较假手术组小鼠(Sham组)和OVX小鼠BMMSCs的成骨能力,Elisa方法检测OVX小鼠体内TNF-α的表达水平。在成骨诱导的过程中,用10ng/mLTNF-α刺激正常C57小鼠来源的BMMSCs,检测Runt相关转录因子2(Runx2)和Osterix等成骨基因的表达水平。去势后的C57小鼠通过尾静脉注射TNF-α中和抗体及空白对照,Micro-CT检测小鼠的骨量及情况。结果:成功建立小鼠OVX模型,OVX组骨密度明显低于Sham组,OVX组BMMSCs的成骨能力明显低于Sham组,OVX小鼠体内TNF-α水平升高;在体外TNF-α能够明显抑制BMMSCs成骨分化能力;注射TNF-α中和抗体后,能够下调小鼠体内TNF-α表达水平,增强小鼠股骨密度。结论:在小鼠雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境下,TNF-α能够抑制BMMSC成骨分化能力,体内注射TNF-α中和抗体能够促进OVX小鼠骨形成,TNF-α抑制骨髓间充质干细胞成骨分化功能可能是绝经后骨质疏松形成的机理之一。
简介:目的:研究衰老骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的氧化应激水平,以及氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)对其成骨分化的影响,探索ROS升高的分子机制。方法:通过碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色及实时定量RT-PCR比较年轻及衰老BMSCs成骨分化能力,利用荧光显微镜及流式细胞术检测BMSCs中ROS水平,并检测超氧化物歧化酶2(superoxidedismutase2,SOD2)及过氧化氢酶(catalase,CAT)在不同BMSCs中的表达水平。结果:发现衰老BMSCs的成骨分化能力较年轻BMSCs显著下降,衰老BMSCs内ROS水平升高是导致其成骨分化下降的重要因素;SOD2及CAT介导的抗氧化机制异常导致ROS上升。结论:抗氧化酶表达下降引起衰老BMSCs内ROS水平升高,抑制其成骨分化。
简介:目的:探究2型糖尿病对大鼠长骨生长的结构指标与骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响。方法:采用高脂食物诱导构建2型糖尿病大鼠模型,取建模成功的2型糖尿病GK大鼠与对照组Wistar大鼠各8只,显微CT扫描检测胫骨形态计量分析;常规培养股骨骨髓间充质干细胞,应用流式细胞仪和CCK-8试验检测细胞增殖与凋亡活性;成骨分化诱导后应用碱性磷酸酶染色试验和qRT-PCR检测成骨分化活性,应用qRT-PCR检测促炎因子和凋亡因子的表达。结果:高脂食物诱导构建2型糖尿病大鼠模型均成功。与对照组比较,糖尿病组大鼠胫骨长度减少、结构模型参数增加(P<0.05),骨小梁矿物质密度、骨小梁厚度、骨小梁间距及骨体积分数无明显差异(P>0.05)。糖尿病组骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨分化能力降低,凋亡活性增高,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α与凋亡因子caspase-3、caspase-8mRNA表达增高(P<0.05)。结论:2型糖尿病短期内对大鼠长骨结构的生长无骨质疏松样改变;2型糖尿病抑制大鼠骨髓间充质干细胞的增殖活性及成骨分化能力,促进凋亡活性,抑制骨形成代谢活动。
简介:目的:探讨肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)对牙周膜干细胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs)和颌骨骨髓间充质干细胞(jawbonemarrowmesenchymalstemcells,JBMMSCs)两种干细胞自噬水平的影响。方法:通过胰酶消化法体外分离培养PDLSCs/JBMMSCs,流式细胞仪及实时定量RT-PCR筛选短时间内不导致细胞凋亡的TNF-α的最大浓度,然后与PDLSCs/JBMMSCs共培养,Westernblot检测不同时间点两种细胞自噬和凋亡的表达水平。结果:成功地筛选出TNF-α的最佳浓度为50ng/mL。采用该浓度作用于PDLSCs/JBMMSCs,短期作用(24h)可以激活细胞的自噬水平,凋亡水平下降;如果TNF-α持续作用,细胞的自噬水平反而下降,凋亡增加。结论:在一定的条件下,TNF-α可以激活PDLSCs/JBMMSCs的自噬水平,免于细胞发生凋亡。
简介:目的:探讨let-7c在体外对大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)增殖及成牙/成骨分化的影响。方法:构建rno-let-7c过/低表达慢病毒载体并且体外转染大鼠BMMSCs,筛选最适转染滴度;倒置荧光显微镜下观察BMMSCs转染后绿色荧光蛋白的表达;实时定量RT-PCR验证rno-let-7c转染效果;CCK-8法和流式细胞术分别检测rno-let-7c过/低表达对细胞增殖和凋亡的影响;Westernblot检测胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)及成牙/成骨指标(RUNX2/OSX/OCN/DMP1)的表达。结果:慢病毒载体转染大鼠BMMSCs最佳条件为MOI=3,成功构建rno-let-7c过/低表达的BMMSCs模型。let-7c过/低表达对大鼠BMMSCs增殖和凋亡均无明显影响(P〉0.05)。与阴性转染组相比,过表达组IGF-1R表达下调,成牙/成骨指标表达下调,而低表达组IGF-1R表达上调,成牙/成骨指标表达上调(P〈0.05)。结论:let-7c对大鼠BMMSCs增殖及凋亡无明显影响,可以抑制其成牙/成骨向分化。
简介:目的探讨纯钛不同形貌表面对骨髓间充质干细胞(MSC)黏附、增殖、分化的影响。方法制备抛光纯钛(MP)、纳米管(TNT)、喷砂酸蚀(SLA)表面,通过扫描电镜(SEM)观察试件表面形貌,激光扫描共聚焦显微镜测量表面粗糙度,表面接触角分析仪分析表面水接触角。通过免疫荧光染色观察不同钛表面MSC形态,细胞计数法检测细胞早期黏附数量,CCK-8法检测细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测ALP活性。采用单因素方差分析进行统计分析,LSD-t检验进行两两比较。结果TNT组表面见排列有序、管径约为80nm的纳米管,SLA组呈微米-亚微米二级孔洞结构。SLA组表面粗糙度(Sa=1.39μm、Sq=1.75μm)最高,TNT组(Sa=1.15μm、Sq=1.48μm)其次,MP组(Sa=0.87μm、Sq=1.14μm)最低,差异有统计学意义(FSa=28.54、FSq=24.70,P〈0.01)。TNT组表面接触角(8.11°)最小,亲水性最佳,差异有统计学意义(F=16.32,P〈0.01)。细胞免疫荧光染色显示MP组MSC呈方形,TNT组MSC呈长梭形,SLA组MSC呈多角形。TNT和SLA组接种30min后的细胞黏附量(132.45、176.90个/视野)高于MP组(64.80个/视野),差异有统计学意义(F=12.05,P〈0.01),接种60min后各组间差异无统计学意义。CCK-8结果显示,接种1、7d后各组间差异无统计学意义;接种3、5d后,MP组细胞增殖活性最高,TNT组其次,SLA组最低,差异有统计学意义(F3d=175.44,P3d〈0.01;F5d=6.329,P5d=0.02)。细胞分化结果显示,7、14dTNT组ALP活性(ALP7d=156.34U/gprot、ALP14d=153.48U/gprot)均显著高于MP(ALP7d=68.21U/gprot,ALP14d=102.73U/gprot)和SLA(ALP7d=65.30U/gprot、ALP14d=86.53U/gprot)两组,差异有统计学意义(F7d=4.93,P7d=0.04;F14d=6.49,P14d=0.02)。结论与微米级SLA表面相比,纳米级TNT表面呈高度亲水性,并更利于MSC的黏附、增殖和骨向分化。
简介:目的观测转染增强型绿色荧光蛋白基因(enhancedgreenfluorescentproteingene,EGFP)并稳定表达前后兔骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)的生物学特性,探讨利用EGFP作为体内试验示踪剂的可行性.方法利用pLEGFP-N1逆转录病毒载体质粒转染PT67包装细胞,提取病毒上清液后感染BMSCs,G418筛选及单克隆培养得到稳定表达绿色荧光蛋白的BMSCs细胞.比较转染前后BMSCs的生长曲线,细胞活性和贴壁率.结果获得了稳定表达绿色荧光蛋白的BMSCs,其生物学特性无明显改变,荧光有效表达时间达3个月.结论利用逆转录病毒法转染EGFP可作为BMSCs体内示踪.
简介:目的:对口腔黏膜癌变的蛋白组学分析和分子标志物筛选可能为早期诊断、预防和分子治疗提供依据和帮助。方法:对3例石蜡包埋口腔黏膜癌变组织样本,利用激光显微切割技术捕获口腔黏膜癌变上皮和癌旁正常黏膜上皮,抽提组织样本蛋白,利用高效液相色谱-质谱联用进行口腔黏膜癌变组织的蛋白组学分析。结果:激光显微切割-高效液相色谱质谱联用可以分析400~700个多肽序列,鉴定出100~200个蛋白,涉及到细胞骨架、细胞代谢、信号转导、细胞周期等各个方面。结合文献,对其中的角蛋白表达变化进行了分析和验证。结论:显微切割结合高效液相色谱质谱可以实现对石蜡包埋组织的蛋白组学研究,具有较高的重复性和可靠性。角蛋白表达谱的变化验证了该平台的作用和价值,也可作为口腔黏膜癌变的潜在标志物。
简介:目的:本研究旨在比较体外三种类型钛表面对促进成骨的作用:掺锶羟基磷灰石(Sr-HA)涂层表面.纳米HA涂层表面以及无涂层的粗糙表面。材料和方法:通过电化学沉积方法将Sr-HA和HA沉积于粗糙的钛表面上。在Sr-HA涂层、HA涂层和无涂层的粗糙钛表面上进行MC3T3-E1前成骨细胞和小鼠骨髓间充质干细胞培养,在不同时间点测定细胞的黏附、增殖、存活、分化和矿化结节形成。结果:对比于无涂层的粗糙钛表面和纳米HA涂层表面,通过简单的电化学沉积处理,Sr-HA涂层明显提高了小鼠骨髓间充质干细胞和MC3T3-E1细胞黏附、铺展,碱性磷酸酶活性和细胞外基质钙矿化。结论:这项研究表明.通过电化学沉积产生的掺锶纳米羟基磷灰石涂层Sr-HA提高了微粗糙钛表面的骨传导性。
简介:目的研究转化生长因子β1(TGF-β1)对舌鳞状细胞癌(TSCC)糖酵解活性和上皮间充质转化(EMT)及迁移与侵袭的影响。方法利用10ng/mLTGF-β1处理TSCCSCC9细胞1、2、3d,收集细胞上清液检测葡萄糖和乳酸表达变化;蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测TGF-β1处理1、2、3d后糖酵解关键酶表达变化;应用10ng/mLTGF-β1处理TSCCSCC9细胞2、4、6d,在倒置显微镜下定时观察细胞形态;Westernblot检测TGF-β1诱导2、4、6d后EMT上皮标记蛋白E-cadherin、间质标记蛋白Vimentin、Snail和Slug的表达变化;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力;同等培养条件下未经TGF-β1处理的为对照组。SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果在TGF-β1诱导条件下,TSCCSCC9细胞葡萄糖摄取量在2和3d时[(34.1±1.2)、(47.1±2.3)mmol]较对照组显著升高(t2d=17.941,P2d=0.003;t3d=24.430,P3d=0.002),同时SCC9细胞乳酸生成量在2和3d时[(46.4±1.0)、(60.2±2.0)mmol]较对照组明显增加(t2d=50.230,P2d=0.005;t3d=26.883,P3d=0.004);TGF-β1处理后,糖酵解关键酶HK2表达在2和3d时(1.21±0.04、1.30±0.06)均高于对照组,差异有统计学意义(t2d=6.111,P2d=0.026;t3d=6.423,P3d=0.023);糖酵解关键酶PKM2表达在2和3d时(1.048±0.002、1.071±0.010)与对照组相比,差异无统计学意义(t2d=20.693,P2d=0.072;t3d=9.875,P3d=0.081);糖酵解关键酶PFKP在2和3d时(0.820±0.010、0.839±0.036)表达较对照组明显升高(t2d=21.829,P2d=0.020;t3d=9.853,P3d=0.022);糖酵解关键酶GLUT1表达在2和3d时(0.503±0.007、0.589±0.019)均高于对照,差异具有统计学意义(t2d=30.693,P2d=0.015;t3d=21.173,P3d=0.012)。在TGF-β1诱导下,与对照组相比,TSCCSCC9细胞从鹅卵石状变为长梭形,同时EMT上皮标记蛋白E-cadherin表达在2、4和6d时(0.69±0.03、0.67±0.04、0.65±0.04)较对照组降低,差异有统计学意义(t2d=7.187,P2d=0.019;t4d=6.631,P4d=0.022;t6d=6.690,P6d
简介:目的:评价选择性激光熔化成型技术制备Ti6Al4V对骨髓间充质干细胞的生物学行为的影响。方法:应用选择性激光熔化成型技术制备Ti6Al4V合金及纯钛材料。培养比格犬的骨髓间充质干细胞,将其接种于两种材料上,计算细胞在两种材料上的相对增殖率及存活率,并根据细胞相对增殖率对细胞毒性进行分级,并计算细胞早晚期凋亡率及总凋亡率。结果:经过72h的复合培养,纯钛的细胞相对增殖率(97.26±3.78)%优于Ti6Al4V合金(91.77±2.65)%,但无统计学差异,两组的毒性分级均为1级,表明两种材料均无细胞毒性;两组间的细胞存活率无统计学差异。各组材料与犬骨髓间充质干细胞共培养48h后,早期细胞凋亡率、晚期细胞凋亡率及总凋亡率Ti6Al4V试件组、纯钛试件组均高于DMEM组,差异均有统计学意义(P〈0.05),但Ti6Al4V试件组与纯钛试件组之间无统计学差异(P〉0.05)。结论:两种钛材料对细胞均无细胞毒性,都表现了较好的细胞存活率,两种材料间未见对细胞凋亡的差异,相容性良好。