简介：目的：利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）纤突糖蛋白S。方法：根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物，并在5’引物和3’引物中引入EcoRI、NotI酶切位点，2。2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体，再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接，SalI线性化重组穿梭质粒pPIC9k—S，电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞，G418筛选鉴定阳性重组子，经甲醇诱导，SDS—PAGE检测诱导后上清。结果：对pPIC9k—S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因；重组酵母菌诱导表达后，SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量为为82×10^3，且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论：利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒（河北分离株）纤突糖蛋白S。

简介：目的：研究抗人表皮生长因子受体2（HER2）人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法：合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果：表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论：实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

简介：按照人脑源性神经营养因子(hBDNF)基因成熟肽编码序列设计合成引物,从人基因组DNA中扩增出360bp的片段,插入到改构载体pTIG-trx上,获得了pTIG-trx-BDNF原核表达重组质粒,限制性酶切分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为hBDNF基因成熟肽编码序列.将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并对表达产物进行了分离纯化,得到纯度大于83%的样品,Western杂交证实该蛋白具有hBDNF抗原活性.

简介：目的：获得齐口裂腹鱼过氧化物酶体增殖物激活受体Y辅助活化因子1a（PGC-1a）cDNA序列，探讨其在齐口裂腹鱼肌肉组织中的表达规律。方法：根据斑马鱼基因PGC-1a序列设计引物，提取齐口裂腹鱼肌肉组织总RNA，经RT-PCR扩增PGC-1a仪基因序列；利用半定量RT-PCR分析齐口裂腹鱼PGC-1a基因在红肌和白肌中的mRNA表达特性。结果：获得齐口裂腹鱼PGC-1a基因序列2633bp，GenBank登陆号为JNl95738，其中ORF为2631bp，编码876个氨基酸残基，与同鲤科的斑马鱼、草鱼和金鱼的同源性较高，为88％～93％，但与哺乳动物和禽类如人、小鼠、大鼠、猪、牛和鸡的同源性较低，为49％～50％。在基础状态下，PGC-1a在齐口裂腹鱼红肌中的表达显著高于白肌，禁食可显著诱导PGC-1a在红肌和白肌中的表达水平。结论-首次克隆得到齐口裂腹鱼PGC-1a基因序列，其在红肌中的表达显著高于白肌中，禁食可显著诱导其在红肌和白肌中的表达，为研究PGC-1a在齐口裂腹鱼肌肉中的作用提供了理论依据。

简介：传统的蛋白质组定量策略主要是通过双向凝胶电泳来进行相对定量.由于该方法不能对相对分子质量极高或极低、等电点极酸或极碱和含量低的蛋白质以及膜蛋白质等进行有效分离和检测,所以已不能适应目前蛋白质组研究深入发展的需要.近年来,定量蛋白质组学的发展主要是以同位素亲和标签试剂为代表的、以质谱检测为核心的稳定同位素化学标记方法.稳定同位素化学标记结合质谱技术,使定量蛋白质组的分析更趋简单、准确和快速,具有良好的发展前景.本文对稳定同位素化学标记结合质谱技术在定量蛋白质组学中的研究进展进行了评述.

简介：目的：利用毕赤酵母野生型菌株GS115（his4）和突变型菌株GJK01（ura3,ade1,arg4,his4,och1）表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）,并对其活性及糖基修饰情况进行比较。方法：用PCR技术扩增目的基因,引入XhoⅠ、NotⅠ双酶切位点,构建pPIC9-hGM-CSF表达载体,电击转化毕赤酵母GS115和GJK01感受态细胞,得到工程菌;经甲醇诱导,对其表达产物进行糖基分析和生物学活性分析。结果：hGM-CSF在野生型菌株GS115和突变型菌株GJK01中均得到表达,其中野生菌表达的为过度糖基化的糖蛋白,而突变型菌株表达的为低糖化的糖蛋白,且二者均可刺激TF-1细胞的生长,比活性分别为9.79×105和2.21×105U/mL。结论：利用酵母工程菌表达了低糖化的重组hGM-CSF,为其药物研究提供了新的思路,也为酵母的糖基工程改造提供了良好的糖蛋白模型。

简介：由于国际上对转基因产品的安全性存在较大争议,因此对没有加施标签予以声明的情况下大量进入中国市场的转基因产品进行检测就显得十分迫切且意义重大.本研究以进口转基因抗草甘膦油菜籽和大豆为材料,通过比较分析外源的CP4-EPSPS基因的核苷酸序列和表达的氨基酸序列,设计出两对不同的引物,采用PCR方法分别对转基因油菜籽和大豆中外源的CP4-EPSPS基因进行了检测.

简介：目的：融合表达结核分枝杆菌Rv3881c突变子抗原，以便与其他已知的免疫显性抗原联合使用，有效增加结核分枝杆菌感染血清学检验的敏感性和特异性。方法：将克隆的来源干结核分枝杆菌H37Rv株的Rv3881c突变体基因插入原核表达载体pET24b，并在大肠杆菌BL21中获得高效表达；由于重组的Rv3881c突变子抗原片段同C端的6xHis标签融合表达，使用Ni-柱进行快速纯化。结果：Western印迹表明，重组的Rv3881c突变子抗原同选取的6例结核病阳性临床血清标本均能发生明显的反应。结论：重组Rv3881c突变体具有较好的特异性，提示该抗原可能成为检测结核的有效抗原之一。

简介：构建了二氢叶酸还原酶（dhfr）选择基因启动子上游无增强子（cnhancer）的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-dhfr-）。用氨甲喋呤（MTX）筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10-7mol/LMTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/106细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。

简介：本研究首次用RT-PCR技术分两段扩增了我国猪瘟病毒(HCV)标准强毒石门株的主要保护性抗原E2基因,并将其进行了克隆和序列分析。将这两个片段连接成完全的E2基因,并将其克隆到原核表达载体pBV220和pET-28a(+)中,重组表达载体转化、诱导的受体菌经Western印迹和直接ELISA检测能够表达E2抗原。用RT-PCR技术对从我国多个地区收集的猪瘟病料进行检测,结果从吉林、长春、南京、重庆、昆明、佛山病料中扩增出了HCVE2保

简介：目的：探讨错配修复基因1（hMLH1）、错配修复基因2（hMSH2）启动子区甲基化与子宫内膜异位症的关系。方法：采用甲基化特异性PCR方法检测23例子宫内膜异位症组织和20例正常子宫内膜中hMLH1、hMSH2基因启动子区的甲基化状态。结果：hMLH1基因在子宫内膜异位症中的甲基化率为39％（9/23），在正常子宫内膜组织中的甲基化率为5％（1／20），两者比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；hMSH2基因在子宫内膜异位症中的甲基化率为8％（2／23），在正常子宫内膜组织中的甲基化率为5％（1／20），两者比较，无明显差异（P〉0．05）。结论：hMLH1基因启动子区甲基化可能与子宫内膜异位症发病有关；hMSH2基因启动子区甲基化与子宫内膜异位症之间不存在显著联系。

简介：乙肝病毒前S1抗原含多个免疫优势表位及乙肝病毒肝细胞受体结合位点,具有重要的生物学功能.为使其高效、可溶性表达,在DnaStar软件辅助分析下,将前S1基因5′端复杂二级结构突变后,克隆入原核表达载体pQE-30a,转化大肠杆菌M15感受态细胞,经IPTG诱导后,获得了高水平、可溶性表达;并对其进行了纯化和鉴定,为进一步研究乙肝病毒前S1抗原的结构功能特点奠定了基础.

简介：目的：融合表达表皮生长因子受体（EGFR）胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法：通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果：经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5nmol/L。结论：利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。

简介：目的：对北京地区成人呼吸道感染患者中人冠状病毒（HCoV）HKUl的感染状况进行初步分析，了解其流行分布、临床特点，并确定流行株的基因型别。方法：2011年1月～2012年1月从北京地区成人呼吸道感染患者中收集鼻咽拭子标本559份，利用靶向棘突蛋白S与核心蛋白N的2种巢式PCR方法进行HCoV—HKUl筛查，并对阳性片段进行序列测定，以确定其基因型别；同时，对阳性标本进行常见呼吸道病毒的共感染筛查，进而分析HCoV—HKUl感染的临床表现和流行病学特点。结果：559份鼻咽拭子标本中检出HCoV—HKUl阳性9例（1．61％），其中3例合并HCoV-0C43感染；感染患者临床表现为急性呼吸道症状，以发热（88．9％）、咽痛（66．7％）、寒颤（68％）、流涕（55．6％）和咳嗽（44_4％）为主，其中1例有系统性红斑狼疮史；阳性基因片段系统进化分析发现这9例感染均为HCoV—I-IKUlB型。结论：北京地区近年成人呼吸道感染患者中HCoV—HKUl感染率较低（1．61％）。其流行株基因型为B型。

简介：随着网络和计算机技术的快速发展,虚拟现实技术作为一种新的技术运用于教学领域,大大弥补了传统教学模式的不足,并在提高教学效率、改善教学评价及教学效果方面有积极影响,本文结合自身教学实践,同时基于涉外导游课程本身所具有的教学特点的分析,探讨虚拟现实技术在旅游专业教学中的应用以及对涉外导游课程实训的影响,并指出了虚拟旅游教学系统应用过程中存在的不足及解决思路。

简介：目的：建立基于Tet-on系统的可调控真核细胞表达小鼠尿激酶原激活剂（uPA）的诱导表达系统。方法：提取C57小鼠肾组织总RNA,RT-PCR扩增uPAcDNA序列;提取基因组DNA,扩增uPA编码区后最后一个外显子序列,构建pTRE2-uPAcDNA-700载体,将其与pTet-on瞬时共转染Huh7细胞系,24h后用强力霉素诱导表达,诱导后36h分别收集细胞和培养上清（诱导组）,提取细胞总RNA并进行细胞uPA转录水平的检测;采用溶圈法对细胞分泌至培养上清中uPA的生物活性进行检测,同时以转染但未诱导Hun7（未诱导组）和正常培养Huh7（正常对照组）细胞及培养上清作为对照。结果：与未诱导组和正常对照组相比较,仅诱导组在转录水平上扩增出目的条带;溶圈法证实转染的细胞不仅表达uPA,而且表达的蛋白具有一定的生物活性。结论：构建了可调控的uPA真核诱导表达系统,为进一步制备可调控肝细胞表达uPA转基因小鼠及进一步揭示uPA肝损伤机理奠定了基础。

简介：人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种用于治疗血栓性心血管疾病的特效药物,它能激活血纤维蛋白酶原,后者使血块溶解,所以这种药物的开发为社会普遍重视。t-PA在人体血液中的含量极低,很难从天然材料中提取。如果应用转基因技术,将人t-PA基因转入动物体内,使其在乳腺中高效表达,从乳汁中提取大量的t-PA,将具有可观的经济效益和社会效益。转基因动物建立的前提条件是构建乳腺定位高效表达载体。为此,我们先将本所保存的t-

简介：人工合成了芋螺毒素SO3的基因片段,通过链延伸方法获得了SO3的全长基因.在此基础上,将SO3基因插入到含抗大鼠转铁蛋白受体的单链抗体基因的pTIG-Trx表达载体中,构建含抗大鼠转铁蛋白受体单链抗体和SO3融合基因的重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)和Origmia(DE3)/DsbC并得到了表达,该融合蛋白主要以包涵体形式存在.为进一步研究芋螺毒素SO3跨血脑屏障转运和治疗作用奠定了基础.

简介：目的：在类风湿性关节炎（RA）成纤维样滑膜（FLS）细胞中筛选并鉴定盘状结构域受体2（DDR2）的相互作用蛋白,并研究其对FLS细胞侵袭能力的影响。方法：首先利用免疫沉淀结合SDS-PAGE分离鉴定DDR2互作蛋白波形蛋白,进而采用免疫沉淀和激光共聚焦实验,进一步验证波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,最后采用Transwell实验考察波形蛋白对RAFLS细胞侵袭能力的影响。结果：Ⅱ型胶原刺激引起RAFLS细胞中DDR2的磷酸化水平升高,DDR2被活化,活化前后共有8个DDR2相互作用蛋白发生变化,经质谱分析,其中变化最大的是波形蛋白和膜联蛋白A2;在HEK293T细胞中,免疫共沉淀结果显示FcDDR2与波形蛋白存在相互作用;激光共聚焦结果显示在RAFLS细胞中,DDR2和波形蛋白存在共定位;下调RAFLS细胞中波形蛋白的表达后,细胞的侵袭能力较对照组显著下降。结论：波形蛋白是DDR2的相互作用蛋白,Ⅱ型胶原可引起RAFLS细胞的DDR2磷酸化水平升高,并通过波形蛋白促进RAFLS细胞的侵袭。