响应面分析法优化盐酸丁螺环酮微球制备工艺研究

【摘要】  　　目的用拟合响应曲面法对盐酸丁螺环酮的制备工艺进行改良，并考察其体外释放。方法聚乳酸羟基乙酸(PLGA)为载体，采用复乳-溶剂挥发法制备盐酸丁螺环酮PLGA微球。结果微球颗粒圆整，大小均匀，观察其体外释放，在2～11d之间，微球持续恒速释放药物。结论　所制微球具有很好的缓释作用，操作方便，工艺稳定，有利于工业化生产。

【关键词】  拟合响应曲面法 复乳-溶剂挥发法 盐酸丁螺环酮 微球

　　Abstract：ObjectiveTo optimize the preparation of Buspirone Hydorchloride microspheres by response surface analysis， and investigate the in vitro release. MethodsUsing PLGA as carrier， we synthesized Buspirone Hydorchloride PLGA-microspheres with double emulsion/ solvent evaporation method. ResultsThe morphology of microspheres was spherical and well distributed. The release property of microspheres in vitro was stable between 2 to 11 days. ConclusionThe microspheres sustained released well in vitro and in vivo and its convenient preparation is suitable for industrialization and production.

　　Key words：Response Surface Analysis;  Double Emulsion/ solvent Evaporation Method;   BuspironeHydorchloride;   Microspheres
   
　　盐酸丁螺环酮是美国用于临床的第一个新型的抗焦虑药物，它具有和BDZ类药物相当的抗焦虑作用，但无催眠、抗痉挛和肌松弛效应，被称为“选择性抗焦虑剂” ［1，2］。从盐酸丁螺环酮的目前给药剂型来看，长期以来一直只有普通的片剂，具有肝脏首过作用强，生物利用度低，血药浓度波动大，有峰谷现象［3，4］等普通片剂普遍存在的缺点，一定程度增加并发症风险。此外，其给药剂量之大，疗程之长和服药次数之多，给患者带来诸多不便，多数患者无法坚持每天按时服药。因此其缓释制剂的开发具有重要意义。
   
　　拟合响应曲面法(Response Surface Analysis) 是近几年发展起来的一种分析方法， 其原理是通过一系列确定性试验拟合一个响应面来模拟真实的极限状态曲面， 从而很容易地进行可靠性分析［5～9］。响应面分析法采用多元二次回归方法作为函数估计的工具， 将多因子试验中因子与指标的相互关系用多项式近拟， 研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系， 并依此从响应面的形状上找到最佳控制点。响应面分析法以最经济的方式、较少的实验次数和较短的时间对所选实验参数进行全面分析， 以得出正确结论， 其优越性已为越来越多的研究人员所关注并应用于各种生物、化工处理过程。
   
　　本文以生物可降解材料制备长效盐酸丁螺环酮PLGA缓释微球，采用拟合响应曲面法优化其制备工艺，并对其体外释放的情况进行研究。

　　1  试剂与仪器
   
　　盐酸丁螺环酮（恩华药业集团有限责任公司）；聚乳酸羟基乙酸（PLGA7525HIGH，美国MEDSORB公司）；聚乙烯醇(PVA 150S ，韩国进口；二氯甲烷（天津市化学试剂一厂）；乙醇（中国医药集团上海化学试剂公司）；色谱甲醇（天津市四友生物医学技术有限公司）；磷酸二氢钾（上海试剂总厂）；氢氧化钠（济南化学试剂厂）；透析袋（截流分子量10 000）；其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。数显恒速搅拌器（S312-250，上海申生科技公司）；循环水式真空泵〔SHZ-D（Ⅱ），巩义市予华仪器厂〕；电子天平（AG135  METTLER TOLEDO公司）；紫外-分光光度计(UV-2450，SHIMADZU)；光学显微镜；WH－2型微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；KQ-250E医用超声仪（昆山超声仪器有限公司）；TGL-16B型台式高速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；气浴恒稳震荡器（江苏省宏华仪器厂）；高效液相色谱（Waters 515 pump ，2487紫外检测器）。

　　2  方法

　　2.1  盐酸丁螺环酮微球的制备精密称取聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶解于二氯甲烷及乙醇中［10］，溶解后加入盐酸丁螺环酮溶液，超声乳化均匀;室温条件下将初乳缓慢注射进高速搅拌的一定浓度的聚乙烯醇（PVA）外水相中，采用层流剪切乳化法乳化，控制乳化时间;将乳状液倾入到蒸馏水中，继续搅拌，使有机溶剂挥发固化完全，所得微球经过滤器抽滤收集，用乙醇或水溶液清洗，真空干燥若干小时。

　　2.2  盐酸丁螺环酮微球制备工艺的考察 用中心组合设计法(Central composite design， CCD)进行各影响因素的分析。
   
　　考察因素（自变量）：
   
　　X1-油/水体积比(v/v)；X2-油相中聚合物（PLGA）浓度(mg·ml-1)；X3-PVA浓度(g·ml-1)；X4-乳化转速(r·min-1)；X5-投药比(g/g)
   
　　考察指标（因变量）：

　　Y1-平均粒径（μm）；Y2-收率(%)；Y3-包封率(%)；Y4-载药率(%)。

　　2.3  考察指标的测定方法

　　2.3.1  粒径取少量微球置于载玻片上，滴加少量0.02%的吐温20溶液进行分散，然后在具刻度目镜的显微镜下观察，并记录分布载玻片5个以上不同区域微球的粒径，微球记数总数为200个。然后通过SPSS软件处理，求得微球的平均粒径。

　　2.3.2  收率收集冷冻干燥后的所有微球，在精密电子天平上称重后除以总的投药量即得，计算公式：收率（%）=所得微球质量/总投料量×100%

　　表1  考察因素及水平（略）

　　2.3.3  包封率在离心力作用下，微球完全沉淀，测定上清液中药物的含量。计算微米粒中药物的包封率公式：X(％)＝(Wtotal－Wfree)/Wtotal ×100% 。其中Wtotal：加入BUS的总质量；Wfree：上清液中BUS的质量。

　　2.3.4  载药率称取一定量的微球，用二氯甲烷溶解，0.1M盐酸稀释，0.45 μm滤膜过滤，紫外测定，按标准曲线方程计算含药量，微球的载药量(DL)的计算公式如下：
   
　　DL(％)＝WBUS/WMS×100%
   
　　其中WBUS：测得盐酸BUS的总质量；WMS：微球总质量。DL(％):载药量。

　　2.4  盐酸丁螺环酮微球体外释放的研究通过盐酸丁螺环酮微球体外释放行为的研究，能够预测其在体内的释药情况，了解其释药的机理，指导微球制备的处方和工艺，对于盐酸丁螺环酮微球质量标准的建立提供依据。本实验中采用高效液相色谱法(HPLC)测定其浓度。微球制剂体外释放实验目前常用的释放介质为pH=7.4的磷酸缓冲溶液，采用pH=7.0的缓冲液作为微球的体外释放介质亦有报道。

　　2.4.1    色谱条件色谱柱：ZORBAXSB-C18柱 。流动相：甲醇-乙腈-水-0.1 mol/L醋酸钠（pH 4.5）=10:38:51:1。流速：1.0 ml/min。检测波长：237 nm。进样量：20 μl。柱温：40℃

　　2.4.2  标准曲线的建立 精密称取盐酸丁螺环酮25 mg置50 ml量瓶中，以0.1MHCl溶解并稀释至刻度，摇匀，取1 ml于10 ml容量瓶中，0.1MHCl稀释到刻度摇匀，得储备液(50.0 μg/ml)。精密量取储备液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.4 ml置10 ml容量瓶中，以0.1释放介质稀释至刻度，摇匀。0.45μm滤膜过滤后 20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，计算峰面积，以连续5次进样测定的峰面积平均值对盐酸丁螺环酮的浓度作线性回归，得标准曲线。

　　2.4.3  盐酸丁螺环酮微球体外释药实验取各批盐酸丁螺环酮微球5 mg 3份，将称量好的微球置于事先处理好的透析袋中，加入pH 7.4的PBS 2 ml，扎紧袋口，放入18 ml pH 7.4的PBS，于恒温震荡器上释放。
   
　　恒温震荡器的温度设置为37 ℃，转速为110 r/min，在3，6，12，24h分别取样0.5 ml，之后每24 h更换1次新介质，取出的介质经0.45μm滤膜过滤，采用HPLC法测定盐酸丁螺环酮的含量。
   
　　计算累积释放量，绘制体外释放曲线。

　　3  结果与讨论

　　3.1  各因素对粒径（Y1）的影响分析 方差分析结果如表2。
   
　　方差分析表明：聚合物浓度X2（P=0.001 000），转速X4（P=0.000 027）对粒径影响显著；同时，聚合物浓度X2及转速X4相互作用对粒径影响也是统计显著的（P=0.036 421）。
   
　　Pareto 图也可看出同样结果，见图1。
   
　　以聚合物浓度X2（P=0.001 000）和转速X4（P=0.000 027）为因素，拟合响应曲面如下，考察其对粒径的影响。
   
　　由响应面可得随着聚合物浓度（X2）的增加，粒径（Y1）显著增加，在聚合物浓度达到最值的时候可得到粒径的最值。当乳化转速增大的时候，粒径显著减小。聚合物浓度的增大，液滴表层的粘度强度增大，对剪切力的耐受力也增强，在外界输入能量相当的情况下，乳化形成的稳态液滴粒径也相应增大，最终形成的微球的粒经也增大。乳化转速的增大，机械搅拌对乳化体系输入的能量也就增加，液滴受到的剪切力的作用也增大，在此情况下，液滴将以分裂减小的乳滴粒径的方式，增大其液滴表面张力及其他内聚力与外界流体的作用力抗争，最终维持体系的平衡形成稳态，这直接导致了该状况下制备的微球粒径的减小。在对处方进行优化的过程中，粒径大小的调节可以响应面拟合出来的规律，对处方，工艺进行调整，以获得最佳的方案。

　　表2  粒径的方差分析结果（略）

　　图1  各因素对粒径的Pareto图（略）

　　3.2  各因素对收率（Y2）的影响分析方差分析结果如表3及图2。
   
　　X5（投药比）对收率Y2影响显著（P=0.000 004），其他因素对其影响不大。
   
　　由相应曲面可以看出，随着投药比的增大，收率明显增加，当投药比增大到一定程度时，收率取得最大值，之后再增加投药比，收率反而有所下降。PVA浓度的增加对投药比的影响不大，PVA浓度为1～1.75 g/ml之间时，收率取得最大值。因此，收率的增加，需要适当调节处方工艺，以取得最佳效果。3.3  各因素对包封率Y3的影响分析 方差分析结果如表4。

　　表3  各因素对收率的方差分析（略）

　　图2  各因素对收率的Pareto图（略）

　　表4  各因素对包封率的方差分析（略）

　　Pareto图如下，分析结果与方差分析结果相一致，见图3。

　　图3  各因素对包封率的Pareto图（略）
   
　　分析显示聚合物浓度X2(P=0.033 963)、转速X4（P=0.032 354）还有投药比X5（P=0.000 060）对包封率影响显著，对转速X4及投药比X5对包封率作响应面。
   
　　由响应面可以看出，随着在转速及投药比的变化，包封率也有显著变化，在投药比最高值区域及转速最小值时可获得最高的包封率。
   
　　对油水相比X1和PVA浓度X3对包封率作响应面。

　　3.4  各因素对载药率Y4的影响分析 方差分析结果如表5。

　　表5  各因素对载药量的方差分析（略）

　　Pareto图如下，分析结果与方差分析结果均显示聚合物浓度X2（P=0.015750）及投药比X5（P=0.024501）对载药量Y4影响显著，见图4。

　　图4  各因素对在药量的Pareto图（略）
   
　　响应曲面显示投药比（X5）对微球载药率的影响极显著，在X5为1:4时载药率达到最高。聚合物浓度（X2）的变化对载药率的影响也相当明显，当X2在62.5～90之间时，Y4取得最大值。在处方优化过程中，提高载药量的最有效直接的方法可选择改变投药比。

　　3.5  工艺优选 根据上述响应面分析对盐酸丁螺环酮各项指标的考察，得到最佳的工艺条件和制备处方如表6，所得微球质量指标如表7。

　　表6  盐酸丁螺环酮微球最佳工艺参数表（略）

　　表7  盐酸丁螺环酮微球质量指标表（略）

　　3.6  盐酸丁螺环酮微球体外释放的研究 用所得的最优化工艺制备盐酸丁螺环酮微球，该微球在介质为pH7.4 PBS长期体外实验的释放结果如表8，累积释放曲线如图5，微球略有突释，在2～11 d之间，微球持续恒速释放药物。

　　表8  体外长期释放结果（略）

　　图5  盐酸丁螺环酮微球在Ph7.4磷酸盐缓冲液中的释放（略）
   
　　生物降解型微球的释药过程与聚合物的降解方式以及药物在聚合物中的扩散行为有关，其释药曲线通常呈零级（ Q=kt）、一级（ q=100-100e-1kt）、Higuchi（Q=kt1/2 ）、Ritger-Peppas（ Q=ktm）、扩散-松弛（ Q=k1t1/2+k2t）、Hixson-Crowell（Q=k1t +k2t2+k3t3）及扩散-溶蚀（ Q=K1t1/2+k2t+k3t2+k4t3）模型。Q为t时间的释药百分率，k为释药速度常数，m为扩散指数。
   
　　用Statistica6.0软件分别对几种释药模式进行拟合，结果如表9，以相关系数R愈大愈好、残差平方和(SUM)愈小愈好为判断标准。    由上述拟合结果可以看出，扩散-溶蚀模型拟合后的残差平方和为170，相关系数为0.997 3。因此，盐酸丁螺环酮微球的主要释药方式可能为扩散和融蚀相结合模型。

　　表9  体外释药拟合方程（略）

　　4  讨论
   
　　制备微球的过程中，处方和工艺参数都会影响到微球的质量。本文以微球的粒径、载药量、包封率和产率等为指标，对含药微球质量的影响因素进行了考察。油/水比例对载药量、包封率和产率的影响均不明显；随着油相中PLGA比例的下降，载药量、包封率、产率均有所降低；水相中PVA的浓度决定了乳化能力的高低，其浓度较高时乳化能力较强，溶液体系稳定。当浓度过低时，产生的微球数量较少，但成球性较好，而浓度过高，形成的微球较易粘连，水洗时不易洗净；随着搅拌速度的增大，载药量略有减小，包封率和产率均有所降低；投药比增加可以显著提高载药量，但包封率明显降低，产率在投药比为1:1时明显降低。
   
　　体外长期释放的结果表明，采用优选的体外加速释放条件可以在较短的时间内对微球的体内释放行为进行模拟，便于快速对微球的释放行为进行考察，控制微球的质量，这对微球处方及制备条件的筛选具有重要意义。

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