小鼠睾丸生殖细胞减数分裂标本制作方法的改进

【关键词】 生殖细胞;减数分裂;标本制备

　　［摘要］目的 对小鼠睾丸生殖细胞减数分裂标本制作方法加以改进，以便使各期分裂细胞增多、背景清晰、结构紧密、图像清楚、利于阅片。方法 小鼠肌肉注射6.5 mg/kg丙酸睾丸酮后继续饲养48 h;处死前腹腔注射秋水仙素，在标本制作过程中采用低渗处理、脱水、中性树胶封片。结果 低倍镜下可见细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期细胞，各期细胞染色体分裂相较常规制片明显增加。结论 方法改进后可见大量分散良好、背景清晰、染色体结构紧凑的生殖细胞减数分裂各期分裂相。

　　［关键词］ 生殖细胞;减数分裂;标本制备

　　A MODIFICATION FOR PREPARING MEIOSIS SPECIMEN OF GENERATIVE CELLS OF MOUSE TESTICLE

　　SU AI， LIU JIN-CHENG， WANG ZHEN-HUA， et al

　　（Department of Biology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）

　　［ABSTRACT］ObjectiveTo improve the meiosis-specimen-making methods so as to get better specimen with more piding cells， clear background， compact chromosome structure， and distinct image. MethodsThe mice were injected intramuscularly with testosterone propionate （6.5 mg/kg） and bred for 48 h. Generative cells were harvested from testicle and treated with colchi-cines. The generative cells underwent hypotonic treatment and dehydration， and were mounted with neutral gum. ResultsAll piding stages （leptotene， zygotene， pachytene， diplotene stages and diakinesis） were observed in low power lens and those pi- ding stages increased greatly compared with the routine method. ConclusionEach piding stage can be observed with clear background， compact chromosome structure and good dispersion with this modified method.

　　［KEY WORDS］germ cells; meiosis; specimen preparation

　　染色体数目的减半和染色体之间的重新组合，是减数分裂两个显著的特点。减数分裂是生物进化的基础，是遗传规律的细胞学基础，是临床医学生必须掌握的知识。遗传学大部分实验课是利用显微镜观察玻片标本，因此玻片标本制作的质量好坏直接影响到教学效果。常规方法制作的小鼠生殖细胞减数分裂玻片标本，只能观察到第一次减数分裂前期Ⅰ的部分时期，如细线期、偶线期和粗线期［1］。典型的各时期分裂相细胞少，染色体短而不清晰，背景模糊，不易观察。为了得到理想的标本，提高教学效果，我们采用改良的丙酸睾酮生殖细胞减数分裂制片技术并获得了理想的效果，现报告如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 6～8周龄健康雄性小鼠8只，体质量20～ 25 g ，由本院动物室提供。

　　1.2 方法小鼠肌肉注射6.5 mg/kg丙酸睾酮48 h后脱颈处死，处死前4 h左右腹腔注射秋水仙素4 mg/kg。处死后的小鼠，取出一侧睾丸放入预先盛有 0.07 mol/L KCl的培养皿中，剥去睾丸被膜，除去附睾、脂肪及结缔组织等。用眼科镊子分离精细小管，移入离心管中于37 ℃水浴低渗30 min;吸去低渗液加入固定液，固定15 min后以1 000 r/min离心8 min，吸去上清液，加入体积分数0.6的醋酸溶液2 mL进行软化，见精细小管溶化时加入固定液吹打均匀，并去除大块组织。以1 000 r/min离心 8 min后， 取沉淀物加入0.5 mL固定液吹打成细胞悬液，冷冻滴片;Giemsa染色8 min，室温干燥后分别在体积分数0.95乙醇和无水乙醇中进行充分脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　2 结果

　　低倍镜下，可见大量分散良好、染色体结构紧凑、背景清晰的小鼠睾丸生殖细胞第一次减数分裂前期Ⅰ的5个时期（细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期）染色体分裂相。分裂细胞较常规制片方法明显增加（图1）。

　　图1 改良方法显示大量分散良好，染色体清晰的偶线期分裂相 ×200（略）

　　3 讨论

　　利用常规小鼠睾丸生殖细胞减数分裂标本制片方法制作的玻片标本只能观察到2～3个细胞分裂期，分裂相少且图像不理想，背景不清晰，观察效果较差。目前减数分裂标本除了直接用睾丸组织制备外，TEMPLADO等［2］发展了用精液制作减数分裂染色体标本的新技术，此技术虽能准确地反映睾丸内精子发生过程的功能状态，但阳性率不高。本实验在总结过去方法的基础上对减数分裂玻片标本制备方法加以改进，采用小鼠肌肉注射丙酸睾酮后，制片效果明显改善，有以下几大优点。①丙酸睾酮是一种人工合成的类固醇激素，能促使生殖器官发育，促进细胞分裂。小鼠肌肉注射丙酸睾酮后可促进其睾丸精母细胞减数分裂和成熟，与常规方法相比，可以获得较多的细胞减数分裂相。本实验结果显示，小鼠睾丸生殖细胞第一次减数分裂前期Ⅰ的5个时期（细线期、偶线期、粗线期、双线期、终变期）染色体分裂相比常规方法明显增加。②常规制片方法中秋水仙素用量为1.5～2.0 mg/kg，本实验采用秋水仙素的量为4.0 mg/kg，作用时间为4 h，实验结果显示效果理想。③常规方法采用0.075 mol/L KCl低渗，本实验降低了低渗液浓度，采用0.07 mol/L KCl溶液，使细胞既能充分吸水膨胀，又不破裂，从而提高了镜下分裂相细胞的检出率。④由于采用乙醇脱水、中性树胶封片，使细胞分裂相背景清楚，图像清晰，且观片后可用二甲苯擦洗，重复使用，提高了实验教学效率。

　　［参考文献］

　　［1］ 刘权章.人类染色体方法学［M］. 北京:人民卫生出版社，1992:328.

　　［2］ TEMPLADO C， MARINA S， COLL M D， et al. Meiotic studies in human semen: report of 180 cases［J］. Hum Genet， 1980，53:335.

　　（本文编辑 厉建强）

　　（青岛大学医学院生物学教研室，山东 青岛 266021）